楊雙娟，徐成權(quán)，吳江維，楊公社

西北農(nóng)林科技大學 動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，楊凌 712100

SOCS3基因重組腺病毒的構(gòu)建及其在豬脂肪細胞中的表達

楊雙娟，徐成權(quán)，吳江維，楊公社

西北農(nóng)林科技大學 動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，楊凌 712100

本研究旨在構(gòu)建細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的重組腺病毒表達載體，獲得有感染性的病毒顆粒。以 pcDNA3-SOCS3質(zhì)粒為模板擴增SOCS3基因，將其亞克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV，經(jīng)測序驗證后，重組的穿梭質(zhì)粒用PmeI酶切線性化后轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細菌中與其內(nèi)的骨架載體pAdEasy-1進行同源重組，獲得的重組質(zhì)粒pAd-SOCS3，經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中進行包裝和擴增，純化后用 TCID50法測定病毒滴度。以重組的病毒感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞后，熒光顯微鏡下觀察報告基因GFP的表達，RT-PCR和Western blotting檢測細胞內(nèi)SOCS3mRNA和蛋白的表達。重組腺病毒載體pAd-SOCS3經(jīng)酶切及PCR鑒定正確，病毒滴度為1.2×109PFU/mL；感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞后，熒光顯微鏡觀察可見報告基因GFP的表達；RT-PCR和Western blotting檢測到細胞中SOCS3mRNA和蛋白的表達顯著提高。本研究成功構(gòu)建了SOCS3基因的重組腺病毒，感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞可穩(wěn)定表達SOCS3蛋白，為深入研究SOCS3的功能奠定了基礎。

SOCS3，重組腺病毒，豬脂肪細胞

Abstract:In order to construct recombinant adenovirus vector expressing Suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)and obtain infectious adenoviral particles,SOCS3gene was amplified from plasmid pcDNA3-SOCS3and subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pAdTrack-CMV.After sequence confirmation, the recombinant shuttle plasmid pAdTrack-CMV-SOCS3was linearized byPmeI, and then transformed into BJ5183 competent cell, the recombinant plasmid pAd-SOCS3was obtained by homologous recombination between pAdTrack-CMV-SOCS3and the adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1 in BJ5183.The pAd-SOCS3was linearized byPacI and transfected into HEK293 cells via liposome.The recombinant adenovirus was packaged and amplified in HEK293 cells.After purifying, virus titer was determined by tissue culture infectious dose 50(TCID50).Using the recombinant adenoviruses to infect porcine primary adipocytes, the expression of green fluorescent protein(GFP)was observed by fluorescent microscopy, andSOCS3gene was identified by RT-PCR and Western blotting.Restriction enzyme and PCR analysis demonstrated that the recombinant adenovirus vector was constructed correctly, and the virus titer reached 1.2×109PFU/mL.The result of RT-PCRand Western blotting showed thatSOCS3mRNA and protein expression was remarkably increased in porcine primary adipocytes infected with recombinant adenovirus.In conclusion, this study successfully constructed the recombinant adenovirus containingSOCS3gene, and can be helpful for further research on the function ofSOCS3.

Keywords:SOCS3, recombinant adenovirus, porcine primary adipocytes

SOCS3(Suppressor of cytokine signaling 3)是1997年發(fā)現(xiàn)的細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族成員之一，最初被認為是JAK/STAT信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子[1-3]。后來許多研究已證實SOCS3主要參與負調(diào)控生長激素(GH)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和瘦素(Leptin)等細胞因子的信號轉(zhuǎn)導[4-7]。近年來，隨著對 SOCS3研究的深入，人們發(fā)現(xiàn) SOCS3參與并抑制了胰島素信號的轉(zhuǎn)導，在胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[8-10]。胰島素抵抗不僅是許多臨床疾病的共同基礎，而且還是誘發(fā)高血壓、Ⅱ型糖尿病、肥胖癥、脂代謝紊亂等綜合征的核心原因。目前，胰島素抵抗已成為全世界生命科學的研究熱點和難點。因此，明確SOCS3在胰島素信號通路中的分子機理，可為治療胰島素抵抗提供新的研究靶點。

豬在心血管解剖結(jié)構(gòu)和功能、脂蛋白分布和大小、肥胖傾向性及種類習性方面，其表現(xiàn)型與人類很相似，而且，它與人類在遺傳學上也具有高度的相似性，特別是遺傳決定的代謝相似性[11]。這使得豬成為了研究人類肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的最佳模式動物，在未來的醫(yī)學研究中發(fā)揮不可忽視的作用。本研究利用含雙啟動子的腺病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了SOCS3基因的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞后獲得了 SOCS3基因的穩(wěn)定表達，為進一步研究SOCS3在豬脂肪細胞胰島素信號通路中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞株、菌種與載體

實驗動物為 3日齡健康長白仔豬(3頭)，體重1.5～2.5 kg，取樣前用0.5%的新潔爾滅清洗0.5 h，電擊處死。Escherichia coli DH5α感受態(tài)細菌購自天根生化科技有限公司。HEK293細胞株、BJ5183感受態(tài)細菌、pcDNA3-SOCS3質(zhì)粒、腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV及骨架載體pAdEasy-1均為本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和其他試劑

內(nèi)切酶Kpn I、Xho I、T4 DNA連接酶、Taq聚合酶、DNA Marker及RNA提取試劑(Trizol)均購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶Pme I與Pac I購自美國New England Biolabs公司；質(zhì)粒抽提和DNA片段凝膠快速回收試劑盒購自 BioFlux公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMEM(低糖)、F12干粉，Ⅰ型膠原酶與胎牛血清購自Gibco公司；牛血清白蛋白購自Amersco公司；胰蛋白酶、HEPES、DMSO購自Merck公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自 Fermentas公司；SOCS3鼠源性單克隆抗體購自美國Millipore公司；羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；蛋白Marker購自南京金斯瑞生物科技公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純；引物合成及DNA測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pcDNA3-SOCS3擴增SOCS3基因

根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3-SOCS3上的人SOCS3基因序列設計合成一對引物，上游引物SOCS3-F：5′-CGG GGTACCGAGCTCGGATCCACTAG-3′；下游引物SOCS3-R：5′-CCGCTCGAGTTAAAGCGGGGCATC GTAC-3′。在上下游引物的 5′端分別引入內(nèi)切酶Kpn I與Xho I的識別序列(即下劃線部分)，并加入保護堿基。

以質(zhì)粒pcDNA3-SOCS3為模板，由上下游引物經(jīng)PCR反應得到人SOCS3基因片段，電泳后回收目的片段。反應參數(shù)：5℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。預期PCR產(chǎn)物長度應為750 bp。

1.2.2 重組病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SOCS3的構(gòu)建與鑒定

將回收的 SOCS3基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV用內(nèi)切酶Kpn I、Xho I進行雙酶切后，電泳并回收片段?；厥债a(chǎn)物(SOCS3片段和切開的 pAdTrack-CMV)在 T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含100 mg/L卡那霉素的 LB平板上進行篩選，挑取單克隆搖菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)Kpn I、Xho I雙酶切和PCR鑒定后，將獲得的陽性克隆質(zhì)粒(命名為 pAdTrack-CMVSOCS3)進行測序。利用NCBI的BLAST比對將測序結(jié)果與GenBank中公布的人SOCS3基因序列進行同源性比較分析。

1.2.3 重組病毒質(zhì)粒pAd-SOCS3的構(gòu)建與鑒定

先將腺病毒骨架載體pAdEasy-1轉(zhuǎn)化到BJ5183細菌中，轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含100 mg/L氨芐青霉素的 LB平板上進行篩選，挑取單克隆搖菌，制備成含有 pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細菌。再將重組的質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SOCS3用Pme I 酶切線性化后轉(zhuǎn)化到含有pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細菌中，與其內(nèi)的 pAdEasy-1進行同源重組，并于含100 mg/L卡那霉素的LB平板上進行篩選，挑取單克隆搖菌，抽提質(zhì)粒，進行Pac I 酶切和PCR鑒定，并將正確的重組質(zhì)粒命名為pAd-SOCS3。

1.2.4 重組病毒的包裝、擴增及純化

將pAd-SOCS3轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細菌中，大量擴繁后提取質(zhì)粒，經(jīng)Pac I酶切、乙醇沉淀后收集 pAd-SOCS3質(zhì)粒，將線性化的 pAd-SOCS3用LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中進行包裝，觀察細胞內(nèi)報告基因GFP的表達及細胞病變(Cytopathic effect，CPE)情況。轉(zhuǎn)染后7 d收集上清作為病毒原液，然后用病毒原液再次感染HEK293細胞，擴增病毒。感染多次后，將收集的病毒經(jīng)CsCl密度梯度離心法進行純化。純化后的病毒命名為Ad-SOCS3，并于?80℃保存。

1.2.5 重組病毒的滴度測定

采用重復性較高的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)法測定重組病毒 Ad-SOCS3的滴度。以 1×104個/孔接種HEK293細胞于96孔板；倍比稀釋病毒，分別以不同稀釋濃度(10?3～10?10)病毒溶液感染細胞；每個稀釋度的病毒溶液以100 μL/孔分別感染10孔細胞，還有 2孔細胞作為陰性對照(不加病毒)。以含 4%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，10 d后觀察每一稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，并計算CPE陽性比率之和(稀釋度為 10?1與 10?2的陽性比率計算在內(nèi)，其值均為 1)。根據(jù) Karbers公式計算病毒滴度：T=10×101+d(s–0.5)TCID50/mL。其中 d = log10 稀釋度=1(對于10倍的稀釋度而言)；s = 陽性比率之和(從第一個10倍比稀釋度算起)。并根據(jù)以下公式，換算成 PFU/mL 單位：T = 1×10xTCID50/mL = 1×10x–0.7PFU /mL。

1.2.6 豬脂肪細胞的原代培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下取仔豬頸部、肩胛及背部皮下脂肪，用含雙抗的PBS緩沖液浸泡、沖洗2次。分離去除脂肪組織中可見的纖維及血管，剪成約1 mm3的組織塊，向剪碎的組織塊中加入1 mg/L的Ⅰ型膠原酶消化液，置37℃振蕩搖床內(nèi)溫育60～80 min后取出，200目細胞鋼篩過濾，濾液以2000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀物用無血清培養(yǎng)液重懸，1000 r/min離心10 min，棄上清，沉積的細胞團塊用基礎培養(yǎng)液制成細胞懸液后以 5.0×104個/cm2密度接種至培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1 d后換液，之后每2天換液1次。直到細胞出現(xiàn)生長抑制。

1.2.7 感染重組病毒的豬脂肪細胞的形態(tài)學及GFP表達的觀察

將接種于六孔板中的原代脂肪細胞移去培養(yǎng)液后，每孔加入500 μL新鮮培養(yǎng)基，1孔為對照，其余每孔分別加入 2、5、10、25和 50 μL病毒液，緩慢搖晃培養(yǎng)板后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3 h，再加入1.5 mL培養(yǎng)基培養(yǎng) 72 h，觀察每孔細胞是否出現(xiàn)CPE。若感染后3 d細胞完全出現(xiàn)CPE的病毒的感染復數(shù)(MOI)值即為10。用60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)豬脂肪細胞，待細胞鋪滿時以篩選的最佳MOI量的病毒感染4皿細胞，感染72 h后在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化及細胞內(nèi)報告基因GFP的表達情況。

1.2.8 感染重組病毒的豬脂肪細胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達的檢測

分別以不同MOI(10，20，30)的重組病毒感染原代培養(yǎng)的脂肪細胞，感染48 h后提取細胞總RNA，RT-PCR檢測SOCS3基因的表達情況，感染72 h后提取細胞的總蛋白，Western blotting檢測SOCS3蛋白的表達情況。RT-PCR檢測時，根據(jù)GenBank中公布的豬SOCS3基因序列設計一對引物，上游引物SOCS3-F(5′-3′)：GTGCGCCATGGTCACCCAC；下游引物 SOCS3-R(5′-3′)：GTCCAGGAACTCCCGAAT。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件One-way ANOVA進行方差分析與顯著性檢驗。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pcDNA3-SOCS3擴增產(chǎn)物的鑒定

以質(zhì)粒pcDNA3-SOCS3為模板，PCR擴增后的產(chǎn)物為單一條帶，大小約為750 bp(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SOCS3的鑒定

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-SOCS3經(jīng)Kpn I、Xho I雙酶切電泳后可見2個條帶，大片段為切開的 pAdTrack-CMV，大小約 9.2 kb，小片段為SOCS3，大小約750 bp(圖2A)，與預期的結(jié)果相一致。以 pAdTrack-CMV-SOCS3為模板，進行 PCR鑒定，結(jié)果可見大小約為750 bp的條帶(圖2B)，與圖A中的小片段相符。將回收的小片段測序后，片段大小為735 bp，與GenBank中公布的人SOCS3基因序列(GenBank Accession No.NM-003955)進行同源性比較分析，核苷酸序列同源性為99%，其中第183位堿基發(fā)生了同義突變，由T→C，對應氨基酸序列同源性為100%，證明pAdTrack-CMV中插入的人SOCS3基因正確。

圖1 pcDNA3-SOCS3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of pcDNA3-SOCS3PCR product.M: DNA marker; 1?3: PCR product of pcDNA3-SOCS3.

圖2 pAdTrack-CMV-SOCS3的鑒定Fig.2 Identification of recombinant pAdTrack-CMV-SOCS3.(A)pAdTrack-CMV-SOCS3was identified by restriction enzyme digestion(KpnI andXhoI).M: DNA marker; 1?3:pAdTrack-CMV(9.2 kb)andSOCS3fragment(735 bp).(B)PCR analysis of recombinant pAdTrack-CMV-SOCS3.M: DNA marker; 1?3: PCR product of pAdTrack-CMV-SOCS3.

2.3 重組質(zhì)粒pAd-SOCS3的鑒定

線性化的 pAdTrack-CMV-SOCS3與 BJ5183中的pAdEasy-1同源重組后，篩選時挑取的3個單克隆質(zhì)粒經(jīng) Pac I酶切后均釋放出一個大小為 4.5 kb的小片段(圖3A)，分別以這3個質(zhì)粒為模板，進行PCR鑒定，結(jié)果均可得到大小為735 bp左右的片段(圖3B)，與預期結(jié)果相符。證明這3個單克隆都為陽性克隆，均為正確的重組質(zhì)粒pAd-SOCS3。

2.4 重組病毒的包裝、擴增、純化及病毒滴度測定

pAd-SOCS3轉(zhuǎn)染HEK293細胞48 h后GFP開始表達，此時在熒光顯微鏡下觀察可見零星、散在的熒光(圖4B)，轉(zhuǎn)染3 d后GFP的表達急劇升高，熒光數(shù)量顯著增加(圖4C)。轉(zhuǎn)染4 d后細胞開始出現(xiàn)典型的 CPE，光鏡下可見原本緊密生長的細胞出現(xiàn)腫脹、變圓、皺縮等明顯細胞病變(圖4D)。轉(zhuǎn)染5 d后由于包裝好的腺病毒釋放到上清中，并感染周圍的細胞，在熒光顯微鏡下可見熒光大量增加，并聚集在一起(圖4E)。隨著時間的延長，整個視野熒光數(shù)量逐漸增多。轉(zhuǎn)染7 d后，95%以上的細胞出現(xiàn)了 CPE變化(圖4F)，而未轉(zhuǎn)染 pAd-SOCS3的HEK293細胞生長正常，仍呈梭形或三角形(圖4A)。包裝好的重組腺病毒Ad-SOCS3經(jīng)擴增和純化后，用TCID50法測定病毒滴度，滴度達到1.2×109PFU/mL。

圖3 pAd-SOCS3的鑒定Fig.3 Identification of recombinant pAd-SOCS3.(A)pAd-SOCS3digested withPacI.M: λDNA/Hind Ⅲ marker;1?3: three clones of pAd-SOCS3, all of them released a 4.5 kb fragment afterPacI digestion.(B)PCR analysis of recombinant pAd-SOCS3.M: DNA marker; 1: PCR product of empty vector,as control; 2–4: PCR product of three clones of pAd-SOCS3in Fig.3A.

2.5 原代豬脂肪細胞的形態(tài)學觀察

經(jīng)膠原酶消化后培養(yǎng)的原代豬脂肪細胞 6 h開始有少量成纖維細胞樣細胞散在貼壁，未貼壁細胞為球形。培養(yǎng)24 h，換液除去未貼壁細胞后，貼壁細胞大部分為短梭形或不規(guī)則的三角形(圖5A)。培養(yǎng) 4 d后，部分細胞開始分化，細胞內(nèi)出現(xiàn)松散的小脂滴，脂滴大小不一、數(shù)量不等，細胞形態(tài)也不一致(圖5B)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞體積增加，胞內(nèi)脂滴逐漸增大并融合在一起，8 d左右，整個細胞充滿脂滴，折光性較強，細胞核被脂滴擠到了邊緣(圖5C)。分化的脂肪細胞經(jīng)油紅 O染色后，光鏡下可見脂滴被染成紅色，而未分化的細胞則沒有著色(圖5D)。

2.6 感染重組病毒的豬脂肪細胞的形態(tài)學及GFP表達的觀察

重組病毒感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞72 h后，置光學顯微鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)與正常細胞和感染只表達GFP空載病毒的細胞(圖6A，B)相比，感染重組病毒后的未分化的脂肪細胞體積減小，整個細胞變瘦拉長，細胞與細胞間的間隙加大，而分化的細胞體積變化不明顯，胞內(nèi)的脂滴大小幾乎不變(圖6C)。在熒光顯微鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)約 80%的細胞都能表達GFP，其中未分化的前體脂肪細胞熒光較弱，而分化的細胞熒光較強(圖6D)。另外，分化的細胞中脂滴內(nèi)無GFP的表達，GFP只定位于脂滴周圍的胞質(zhì)中(圖6D，箭頭所示)。

圖4 重組腺病毒pAd-SOCS3轉(zhuǎn)染HEK 293細胞的觀察Fig.4 Observation of HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3.(A)Normal HEK 293, as control.(B)HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3for 48 h, the GFP began to express.(C)HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3for 3 days, the GFP expression increased rapidly.(D)HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3for 4 days, cells began to appear CPE.(E)HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3for 5 days, the fluorescence of GFP togethered.(F)HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS3for 7 days, above 95%cells appeared CPE.

圖5 原代培養(yǎng)豬脂肪細胞的形態(tài)學觀察Fig.5 Morphology observation of porcine primary adipocytes.(A)Adipocytes were culturedin vitrofor 24 h.Showing stretched fibroblast-like or triangle cell phenotypes.(B)Adipocytes were culturedin vitrofor 4 days.Showing small lipid droplet in cytoplasm.(C)Adipocytes were culturedin vitrofor 8 days.Some small lipid droplets fusing in cytoplasm.(D)Differentiated adipocytes stained by Oil Red O.Lipid droplets were stained red by Oil Red O.

圖6 重組病毒Ad-SOCS3感染原代脂肪細胞的觀察Fig.6 Observation of porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3.(A)Normal porcine primary adipocytes.(B)Porcine primary adipocytes infected by Ad-GFP, as control.(C)Porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3for 72 h , the morphous of adipocytes were changed.(D)Porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3for 72 h, about 80% cells could express GFP.Arrow indicated the GFP localization of differentiated adipocytes.

2.7 感染重組病毒的豬脂肪細胞中SOCS3 mRNA和蛋白表達的檢測

以 MOI為 10、20、30的重組病毒感染原代培養(yǎng)的脂肪細胞48 h后提取總RNA，RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀下照像結(jié)果見圖7A。利用Dolphin-DOC凝膠成像系統(tǒng)軟件測定電泳條帶的OD值，以β-actin基因為內(nèi)參，未感染病毒(MOI=0)的細胞為對照，將SOCS3基因測定得到的OD值與β-actin基因測定的OD值相比，所得數(shù)值利用SPSS軟件進行One-way ANOVA方差分析與顯著性檢驗。分析結(jié)果見圖7B。感染 72 h后提取細胞的總蛋白，以β-actin為內(nèi)參，未感染病毒(MOI=0)的細胞為對照，Western blotting 檢測SOCS3蛋白的表達，結(jié)果見圖7C。由圖A、B可知，感染了重組病毒的細胞中SOCS3基因的表達顯著高于未感染病毒的細胞(P＜0.05)。當 MOI為 10和20時，二者 SOCS3基因的表達差異不顯著，而當MOI為30時SOCS3基因的表達顯著高于MOI為10和 20的細胞。由 C圖可知，基礎狀態(tài)下，SOCS3蛋白的表達量很低，但感染重組病毒后，SOCS3蛋白的表達量顯著提高。

圖7 感染Ad-SOCS3的原代脂肪細胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表達Fig.7 Expression ofSOCS3mRNA and protein in porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3.(A)Electrophoresis result ofSOCS3andβ-actinPCR products in porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3(MOI=0, 10, 20, 30).(B)Quantitation analysis ofSOCS3mRNA relative toβ-actinfrom A.Different letters show significant difference(P＜ 0.05).(C)Western blotting analysis of SOCS3 and β-actin protein expression in porcine primary adipocytes infected by Ad-SOCS3(β-actinas internal control).

3 討論

胰島素抵抗屬于機體糖代謝紊亂的慢性病理過程，是誘發(fā)高血壓、Ⅱ型糖尿病和肥胖癥等綜合征的核心原因。胰島素抵抗由許多因素引起，而胰島素信號傳遞受阻或減弱是導致胰島素抵抗的主要原因之一。胰島素是由胰腺β細胞分泌的激素類物質(zhì)，其主要通過作用于脂肪、肌肉及肝臟 3大靶組織來影響機體的糖代謝和脂代謝。近年來，國內(nèi)外的許多研究表明，胰島素不僅能夠誘導SOCS3的表達，而且其誘導產(chǎn)生的SOCS3能夠特異性地抑制胰島素信號通路，在胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[12-13]。因此，明確SOCS3在胰島素信號通路中的作用及機理能夠為從根本上治療Ⅱ型糖尿病和肥胖癥等代謝綜合征提供重要的理論依據(jù)。

一直以來，關于SOCS3在胰島素信號通路中的研究主要集中在大鼠、小鼠等動物的肝臟及細胞系上，而在脂肪組織及肌肉組織中的研究較少。近年，豬作為最接近人類的模式動物，已成為研究肥胖和糖尿病的理想模型[11]，越來越多地受到研究者的青睞。但到目前為止，有關原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞中SOCS3對胰島素信號通路的作用尚未見報道。本實驗室長期開展有關體外培養(yǎng)豬脂肪細胞的發(fā)育及代謝方面的工作。最初，本研究小組在研究豬脂肪細胞SOCS3的功能時，用含有SOCS3基因的pcDNA3-SOCS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞，經(jīng) G418篩選后發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效率極低，幾乎不超過 2%，遠遠達不到實驗的要求，而轉(zhuǎn)染 3T3-L1脂肪細胞系后，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，能達到 30%～40%。這說明普通質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染對于細胞系是可取的，但對于原代培養(yǎng)的細胞而言，并不是最佳的選擇。

通常情況下，SOCS3以低水平存在于未受刺激的細胞內(nèi)，為了能夠在脂肪細胞中獲得穩(wěn)定表達的SOCS3蛋白，進一步研究其在胰島素信號通路中的作用，本研究選擇了構(gòu)建SOCS3的重組腺病毒表達載體。與其他載體相比，重組腺病毒載體具有靶細胞種類多，導入效率高；可插入大片段外源基因；不整合到宿主基因組中，不會引起插入突變；容易得到高滴度病毒等優(yōu)點，是目前高效蛋白表達和基因治療研究的首選載體[14]。本研究采納的利用AdEasy系統(tǒng)快速獲得重組腺病毒的構(gòu)建方法[15]，與傳統(tǒng)的重組腺病毒構(gòu)建方法相比，操作更為簡單，重組效率更高，獲得的病毒更純，不僅縮短了載體的構(gòu)建時間，而且能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在不同類型細胞中的高效表達。另外，不同物種SOCS3基因的保守性極高，人 SOCS3基因與豬 SOCS3基因核苷酸序列的同源性為94%，對應的氨基酸序列的同源性高達97%?；谝陨蟽煞矫娴目紤]，本研究將外源的人 SOCS3基因插入到腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中，構(gòu)建SOCS3的重組腺病毒表達載體，并用其感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞，以實現(xiàn)SOCS3基因在脂肪細胞中的穩(wěn)定表達。

總之，本研究成功構(gòu)建了SOCS3基因的重組腺病毒Ad-SOCS3，獲得了有感染性的病毒顆粒。病毒滴度高達1.2×109PFU/mL，感染原代培養(yǎng)的豬脂肪細胞后，在熒光顯微鏡下觀察可見80%的細胞表達報告基因GFP。RT-PCR和Western blotting分析結(jié)果證明在感染重組病毒的脂肪細胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表達均顯著提高，即實現(xiàn)了SOCS3基因在原代脂肪細胞中的高效、穩(wěn)定表達。這不僅克服了pcDNA3-SOCS3質(zhì)粒在脂肪細胞中轉(zhuǎn)染效率低的問題，更為進一步研究SOCS3在豬脂肪細胞中胰島素信號通路中的作用奠定了基礎。

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Shuangjuan Yang, Chengquan Xu, Jiangwei Wu, and Gongshe Yang
Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, Northwest A & F University, Yangling 712100, China