成德，雷蕾，盧智娟，李珍，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)的誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定

成德，雷蕾，盧智娟，李珍，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100

通過(guò)外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的誘導(dǎo)，使成體細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)樣的多能細(xì)胞，這種細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，這一方法被稱為iPS技術(shù)。目前，iPS技術(shù)已先后在小鼠、人、獼猴、大鼠和豬中成功應(yīng)用，建立了相應(yīng)的iPS細(xì)胞系，并獲得了iPS細(xì)胞嵌合小鼠和四倍體克隆小鼠。盡管iPS與ES細(xì)胞在形態(tài)和生長(zhǎng)特性上有許多相同之處，但iPS細(xì)胞的建立需要較獨(dú)特的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系和鑒定方法。以下結(jié)合近年來(lái)iPS技術(shù)的發(fā)展和本實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究，對(duì)iPS細(xì)胞的建立和培養(yǎng)體系的優(yōu)化進(jìn)行了深入探討。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞重編程，誘導(dǎo)，胚胎干細(xì)胞

Abstract:The somatic cells can be induced into ES-like stem cells when retrovirally infected the defined transcription factors including Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc.These ES-like cells are named induced pluripotent stem(iPS)cells and this method is called iPS technology.Until the end of 2009, iPS cell lines have been generated in various animal species, such as mouse, human, rhesus monkey, rat and pig.Mouse iPS cells are also used to generate chimera mice and viable mice through the tetraploid complementation.Although iPS cells are extremely similar to ES cells in both morphology and growth features, to generate iPS cells do need the defined culture procedures.Based on the update global iPS technology development and the iPS studies in our laboratory, this paper focused on the establishment of iPS cell lines and improvement of iPS cell culture condition.

Keywords:iPS, transcription factor, reprogramming, induction, embryonic stem cell

1981年，Evans等[1]成功分離出第一株小鼠胚胎干細(xì)胞。至今，胚胎干細(xì)胞已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。尤其是人類胚胎干細(xì)胞的成功建系為再生醫(yī)學(xué)的研究開(kāi)辟了新的途徑，但是免疫排斥和倫理道德問(wèn)題給胚胎干細(xì)胞在臨床應(yīng)用上帶來(lái)了很大的困擾[2]。1997年，克隆羊多莉的誕生使科學(xué)家認(rèn)識(shí)到，通過(guò)卵母細(xì)胞中的母源性表觀遺傳修飾可以使成體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞[3]。這種用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞重編程的研究，由于對(duì)設(shè)備條件要求高，操作技術(shù)復(fù)雜，阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[4]。另外一種進(jìn)行細(xì)胞重編程的技術(shù)是將成體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，使融合后的成體細(xì)胞恢復(fù)多能性，但是融合細(xì)胞由于核型異常等問(wèn)題難以應(yīng)用于臨床上[5-6]。2006年，通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中涉及細(xì)胞重編程的細(xì)胞因子的深入分析和研究，日本科學(xué)家Takahashi和Yamanaka研究小組利用 4個(gè)基因轉(zhuǎn)錄因子，成功在體外將成體細(xì)胞誘導(dǎo)成為胚胎干細(xì)胞樣的多能干細(xì)胞，并將其命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，而產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方法稱為iPS技術(shù)[7]。

1 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)

2006年，日本京都大學(xué) Yamanaka(山中伸彌)教授所率領(lǐng)的研究小組篩選出了 4個(gè)在胚胎干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc，OSKM)，并利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將這些因子轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞中。通過(guò)這些因子在受體細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞去分化，使成體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞，并將其定義為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)[7]。iPS細(xì)胞的主要特征表現(xiàn)為：能夠形成ES細(xì)胞樣的集落，胞核較大核質(zhì)比高，堿性磷酸酶(AP)染色呈陽(yáng)性，表達(dá)內(nèi)源性O(shè)ct4、Sox2和Nanog，端粒酶活性提高，能在裸鼠體內(nèi)形成畸胎瘤等。經(jīng)基因芯片分析，iPS細(xì)胞的基因表達(dá)譜與ES細(xì)胞相類似，而與誘導(dǎo)之前的受體細(xì)胞明顯不同。在小鼠嵌合試驗(yàn)中，對(duì)胎兒進(jìn)行切片染色，證明 iPS細(xì)胞在生殖系中嵌合成功[8-11]。

最初獲得小鼠 iPS細(xì)胞的效率很低，所采用的技術(shù)手段也存在缺陷，例如采用Fbx15基因作為誘導(dǎo)標(biāo)記、在誘導(dǎo)過(guò)程中采用藥物篩選等。因此，有研究者甚至懷疑 iPS細(xì)胞是生物體內(nèi)殘留的極少量干細(xì)胞經(jīng)外源基因的誘導(dǎo)激發(fā)而產(chǎn)生的多能細(xì)胞。但最近幾年，iPS技術(shù)得到了迅速發(fā)展，產(chǎn)生了不同的iPS誘導(dǎo)技術(shù)，例如采用Oct4/Sox2/Nanog/Lin28(OSNL)因子誘導(dǎo)等。至今為止，小鼠、人、獼猴、大鼠、豬等物種都已建立了iPS細(xì)胞系[7,12-15]。而且通過(guò)四倍體囊胚嵌合技術(shù)，證實(shí)了小鼠 iPS細(xì)胞能發(fā)育成為完整的小鼠個(gè)體[16]。目前，iPS技術(shù)已迅速向醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用方面展開(kāi)，特別是在病理模型方面進(jìn)展顯著，已建立了十多種人類疾病模型的 iPS細(xì)胞株[17-18]。不過(guò)要將 iPS技術(shù)應(yīng)用于臨床，還存在如誘導(dǎo)效率低和致瘤性等尚待解決的問(wèn)題[19]。

誘導(dǎo)iPS細(xì)胞產(chǎn)生的技術(shù)手段，主要有如下幾種：

1.1 采用載體誘導(dǎo)

最初為了使導(dǎo)入的外源基因能在受體細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，保證 iPS誘導(dǎo)的成功，采用了能高效整合的反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體。但是病毒載體在受體細(xì)胞基因組中高效隨機(jī)的整合也使得到的 iPS細(xì)胞具有很高的致瘤性。為了解決這一問(wèn)題，又改用基因整合能力低的腺病毒作為載體進(jìn)行誘導(dǎo)，雖然誘導(dǎo)效率明顯降低，但最終成功得到了沒(méi)有病毒整合的 iPS細(xì)胞[20]。而日本一研究小組采用普通質(zhì)粒作為外源因子的導(dǎo)入載體，也成功誘導(dǎo)得到了 iPS細(xì)胞。但是與前者類似，誘導(dǎo)所用的時(shí)間要加長(zhǎng)，且效率很低[21]。上述這些降低病毒副作用的方法，使iPS技術(shù)向臨床應(yīng)用邁進(jìn)了一大步。

以上研究雖然避免了病毒在iPS細(xì)胞中的整合，但是極低的誘導(dǎo)效率極大地阻礙了其在實(shí)際研究中的應(yīng)用。對(duì)此，部分研究小組利用 Cre/LoxP系統(tǒng)[22-23]、oriP/EBNA1載體[24]及 piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[25]等，將外源基因整合到受體細(xì)胞中誘導(dǎo)iPS，然后再將外源基因從 iPS細(xì)胞的基因組中切除，從而得到不含外源基因整合的iPS細(xì)胞。

此外，隨著研究的深入，所需的轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量也越來(lái)越少，最初篩選出的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為OSKM和 OSNL。在隨后的誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)可省去具有致瘤性的c-Myc因子，雖然對(duì)于誘導(dǎo)的時(shí)間和效率有一定的影響，但在很大程度上降低了 iPS細(xì)胞的致瘤性[26]。而誘導(dǎo)本身具有一定多能性的成體干細(xì)胞，只需更少的誘導(dǎo)因子就能得到iPS，如以神經(jīng)干細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，只要轉(zhuǎn)染Oct4單個(gè)基因就能成功得到iPS細(xì)胞[27]。

1.2 采用小分子化合物誘導(dǎo)

最初iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的效率只有0.01%左右。為了提高誘導(dǎo)效率，研究者發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)過(guò)程中在培養(yǎng)基中添加小分子化合物，如：2-丙基戊酸(Valproic acid，VPA)、5-氮雜胞苷(5-AZA)、G9a 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(BIX01294)、鈣通道激動(dòng)劑(BayK8644)等，能促進(jìn)受體細(xì)胞的重編程，顯著提高 iPS的誘導(dǎo)效率[28-31]。這些小分子有的是通過(guò)抑制基因組甲基化作用，直接提高受體細(xì)胞被誘導(dǎo)的效率；有的則通過(guò)影響特定的信號(hào)通路，使誘導(dǎo)過(guò)程中產(chǎn)生的中間過(guò)渡型細(xì)胞和部分重編程的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的完全的多能干細(xì)胞。添加小分子化合物的誘導(dǎo)方法，使一些低效率的誘導(dǎo)技術(shù)，例如蛋白質(zhì)因子誘導(dǎo) iPS的克隆形成率明顯提高[32]。小分子化合物誘導(dǎo)劑的出現(xiàn)，對(duì) iPS技術(shù)走向臨床應(yīng)用起到了顯著的推動(dòng)作用。目前，越來(lái)越多的小分子化合物被發(fā)掘出來(lái)，2009年底報(bào)道的維生素 C促進(jìn)iPS細(xì)胞形成就是一例[33]。人們期待，將來(lái)能夠?qū)崿F(xiàn)完全采用小分子化合物誘導(dǎo)得到的iPS細(xì)胞。

1.3 采用蛋白質(zhì)分子誘導(dǎo)

為了避免病毒和外源基因?qū)Φ玫降?iPS細(xì)胞產(chǎn)生的影響，研究者直接采用以上 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)[32,34]。但是由于蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，不能持續(xù)作用，因此需要對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行多次的蛋白處理。Zhou等采用隔天多次將受體細(xì)胞與外源蛋白進(jìn)行共培養(yǎng)的方法，通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將其運(yùn)送至受體細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，通過(guò)4輪蛋白因子的處理，再結(jié)合VPA的輔助，才最終成功誘導(dǎo)得到iPS克隆[32]。而Kim等則采用穩(wěn)定表達(dá)四因子融合蛋白的HK293細(xì)胞的裂解產(chǎn)物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞，可最初連續(xù) 6 d的誘導(dǎo)處理卻引起受體細(xì)胞的死亡；隨后通過(guò)16 h的蛋白誘導(dǎo)處理與新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d相結(jié)合，進(jìn)行反復(fù)6輪誘導(dǎo)之后才最終得到了 iPS克隆[34]。與之前的實(shí)驗(yàn)相似，蛋白質(zhì)分子誘導(dǎo) iPS細(xì)胞的效率極低，且所需時(shí)間很長(zhǎng)。因此，這種方法還需要進(jìn)一步地探索才有可能在實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。其中特別要解決的問(wèn)題，一個(gè)是體外大量制備高純度的蛋白因子，另一個(gè)是使蛋白因子有效地轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這兩個(gè)問(wèn)題的解決將會(huì)使這一方法得到有效的應(yīng)用。

1.4 采用siRNA誘導(dǎo)

與小分子化合物誘導(dǎo)相類似，在四因子誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上加入對(duì) RNA翻譯水平起特定調(diào)控作用的siRNA也同樣能提高iPS的誘導(dǎo)效率，如p53基因的 siRNA、Utf1基因的 cDNA、Wnt3a等。研究發(fā)現(xiàn)，它們均可以通過(guò)影響與細(xì)胞分化和多能性維持相關(guān)的一些信號(hào)通路，從而促進(jìn)誘導(dǎo)過(guò)程中受體細(xì)胞的重編程，提高 iPS誘導(dǎo)效率，或替代某些誘導(dǎo)因子的使用[36-37]。目前。采用這一方法誘導(dǎo) iPS的報(bào)道還不太多，研究人員還在尋找更多有效的siRNA干擾片段。

2 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系

iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)就是將分化的受體細(xì)胞重編程為多能細(xì)胞的過(guò)程。進(jìn)行 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)主要涉及以下幾個(gè)技術(shù)要點(diǎn)：

2.1 受體細(xì)胞的選擇

iPS技術(shù)雖然在不同物種的多種細(xì)胞上都取得了成功，但是不同的受體細(xì)胞、不同的細(xì)胞狀態(tài)及其傳代代數(shù)，對(duì)于誘導(dǎo)的效率，甚至誘導(dǎo)是否能取得成功都有一定的影響。因此，在實(shí)驗(yàn)之初需準(zhǔn)備符合要求的受體細(xì)胞。

最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纖維細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行 iPS誘導(dǎo)，雖然最終都得到了 iPS細(xì)胞，但是采用胎兒細(xì)胞進(jìn)行的誘導(dǎo)效率明顯要高一些[7]。這可能是由于胎兒細(xì)胞增殖活力強(qiáng)，并且甲基化程度較低，易于重編程。

隨后，以小鼠肝臟細(xì)胞、胃表皮細(xì)胞、胰腺 β細(xì)胞，甚至成熟的B淋巴細(xì)胞作為受體細(xì)胞進(jìn)行iPS誘導(dǎo)也都取得了成功[38-40]，這充分說(shuō)明了 iPS技術(shù)的普遍適用性，也證明了各類體細(xì)胞都具有被重編程為多能性細(xì)胞的潛能。研究發(fā)現(xiàn)不同類型細(xì)胞來(lái)源的 iPS細(xì)胞具有不同的特點(diǎn)，如肝臟細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞來(lái)源的 iPS細(xì)胞其基因組不易被病毒整合，具有較低的致瘤性[38]，更適合于醫(yī)學(xué)研究的需要。Aasen等也發(fā)現(xiàn)以角質(zhì)細(xì)胞作為受體細(xì)胞可顯著提高 iPS的誘導(dǎo)效率，并能降低病毒在受體細(xì)胞基因組上的整合[41]。另外，神經(jīng)干細(xì)胞本身表達(dá)較高的內(nèi)源性Sox2等因子，當(dāng)采用Oct4一個(gè)因子時(shí)，也能產(chǎn)生較高效率的 iPS細(xì)胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞可以作為理想的受體細(xì)胞[42-43]。

不同受體細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)效率的差異至今仍沒(méi)有確切的解釋，但是從 iPS誘導(dǎo)的過(guò)程可以認(rèn)為，這可能是由于不同受體細(xì)胞間的表觀遺傳修飾的差異引起的。不同細(xì)胞基因組的甲基化和乙?；潭雀鞑幌嗤?，誘導(dǎo)重編程過(guò)程中開(kāi)啟外源基因表達(dá)的要求也不一樣，如誘導(dǎo)過(guò)程中添加甲基化酶抑制劑可以明顯提高誘導(dǎo)的效率。同時(shí)，有的受體細(xì)胞自身也表達(dá)部分的誘導(dǎo)因子，這不僅可以減少外源基因的使用數(shù)量，同時(shí)也減輕了重編程的負(fù)擔(dān)，進(jìn)而可以得到較高的 iPS誘導(dǎo)效率，且減少誘導(dǎo)的時(shí)間，例如神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。

由于取材和培養(yǎng)簡(jiǎn)便，原代成纖維細(xì)胞仍然是iPS誘導(dǎo)中最常用的受體細(xì)胞。同時(shí)，為了確保受體細(xì)胞的增殖活力，盡可能使用低代數(shù)(3～5代)的原代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)[44]。不同類型受體細(xì)胞用于 iPS誘導(dǎo)的結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的主要培養(yǎng)操作流程見(jiàn)圖1，具體分為以下幾個(gè)步驟完成：

表1 用于iPS誘導(dǎo)的受體細(xì)胞類型Table 1 Recipient cells used in iPS cell induction

圖1 豬iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間流程Fig.1 The procedure of reprogramming porcine somatic cells to iPS cells.(A)The morphology of the porcine fibroblasts before virus infection.(B)The morphology of porcine fibroblasts changed after 6 days after virus infection.(C)The ES-likes colony of the porcine iPS 13 days after virus infection.

2.2.1 外源轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入

iPS誘導(dǎo)的起始是將外源基因或者外源基因的表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使其在受體細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)早期胚胎基因組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。所用的外源基因以O(shè)SKM為主，同時(shí)增加 Nanog和line28將有助于提高誘導(dǎo)效率[47]。

常規(guī)的操作是通過(guò)病毒載體攜帶外源基因轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為24～48 h，可進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染以提高轉(zhuǎn)染效率。為了保證轉(zhuǎn)染效率，病毒的滴度要求達(dá)到 1×106～5×106以上，病毒轉(zhuǎn)染的當(dāng)天為誘導(dǎo)0 d。轉(zhuǎn)染后撤去病毒液，用新鮮的受體細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24～72 h[44,48]。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于MEF或SNL細(xì)胞飼養(yǎng)層上，在六孔板上細(xì)胞的密度為每孔5×104個(gè)細(xì)胞。生長(zhǎng)24 h后，換上ES培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。但也有人認(rèn)為，病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞不更換新鮮培養(yǎng)液，直接消化后接于明膠鋪底的培養(yǎng)板上可以提高誘導(dǎo)效率，且不需要飼養(yǎng)層的支持，這也是誘導(dǎo)過(guò)程中認(rèn)為不需要飼養(yǎng)層的唯一報(bào)道[31]。對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)室在研究中發(fā)現(xiàn)以上兩種處理之間的差異并不顯著，在較短時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)并不依賴飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持。對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞等能在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出現(xiàn) iPS集落的受體細(xì)胞，可以在病毒轉(zhuǎn)染后直接換上ES培養(yǎng)液，而不進(jìn)行消化重鋪，在出現(xiàn)集落之后再將集落單獨(dú)接種于飼養(yǎng)層上，進(jìn)行下一步的傳代誘導(dǎo)培養(yǎng)[43]。

采用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒進(jìn)行誘導(dǎo)[7,47]，會(huì)導(dǎo)致iPS細(xì)胞具有較高的致瘤性，為此可利用普通的質(zhì)?；虿徽系南俨《镜茸鳛橥庠椿虻膶?dǎo)入載體。鑒于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低，持續(xù)表達(dá)時(shí)間短，因此需要反復(fù)多次對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染[20-21]。如用質(zhì)粒進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入，研究者將Oct4、Sox2、Klf4三個(gè)基因整合到一個(gè)載體上，實(shí)現(xiàn)其共表達(dá)。轉(zhuǎn)染時(shí)將該質(zhì)粒載體與帶有c-Myc的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染，或者反復(fù)交替地分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染要分別進(jìn)行3輪以上，持續(xù) 1周左右，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的高效導(dǎo)入和持續(xù)表達(dá)，但最后得到iPS克隆的效率不到0.001%。

同時(shí)，外源基因?qū)κ荏w細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程似乎不局限于同一物種內(nèi)，異源轉(zhuǎn)錄因子同樣可以誘導(dǎo)受體細(xì)胞成為 iPS細(xì)胞[14]?？赡苡捎诙嗄苄赞D(zhuǎn)錄因子在不同物種之間具有很高的保守性，可以調(diào)控異種受體細(xì)胞基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)重編程過(guò)程。這在早期異種動(dòng)物核移植的研究中也可以印證，但是由于孕期的差異，個(gè)體發(fā)育特異性和核質(zhì)相容等差異，至今未能成功得到異種克隆動(dòng)物。

2009年初，有兩個(gè)研究小組分別用四因子表達(dá)的重組蛋白誘導(dǎo)小鼠和人成纖維細(xì)胞成為iPS細(xì)胞。研究者將 4種蛋白質(zhì)因子帶上信號(hào)肽，將其添加到培養(yǎng)基中與受體細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，然后換上新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，再添加蛋白質(zhì)因子，依次重復(fù)4輪，需9 d左右。然后將細(xì)胞重鋪到飼養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)，并且在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中添加甲基化酶抑制劑VPA[32]。而另一研究小組則對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行 7 d一次的蛋白處理，并且反復(fù)誘導(dǎo)6輪，最后才得到iPS細(xì)胞[34]。與質(zhì)粒誘導(dǎo)的方法相類似，采用蛋白因子誘導(dǎo) iPS的效率很低，小于0.001%，且時(shí)間約為病毒誘導(dǎo)的2倍左右。

2.2.2 誘導(dǎo)后受體細(xì)胞的培養(yǎng)

由于誘導(dǎo) iPS細(xì)胞的過(guò)程較長(zhǎng)，所以，在外源因子導(dǎo)入細(xì)胞后，掌握好對(duì)被誘導(dǎo)的受體細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)至關(guān)重要。將導(dǎo)入外源基因或其表達(dá)產(chǎn)物后的受體細(xì)胞接于飼養(yǎng)層后，第 2天換成相應(yīng)的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，之后每隔24～48 h換液，直至ES樣克隆出現(xiàn)，該過(guò)程一般需要15～20 d[44,48]。有報(bào)道稱，誘導(dǎo)時(shí)間至少需要在10 d以上，不然產(chǎn)生的 iPS細(xì)胞可能不具有完全的多能性[49]。但更多的研究顯示，克隆出現(xiàn)的時(shí)間與受體細(xì)胞的年齡和轉(zhuǎn)染因子的數(shù)量有關(guān)。一般胎兒細(xì)胞要比成體細(xì)胞出現(xiàn)克隆早，上皮樣細(xì)胞所需的誘導(dǎo)時(shí)間要比成纖維細(xì)胞短一些，而以神經(jīng)干細(xì)胞為受體細(xì)胞則僅僅只需要3～5 d就可以出現(xiàn)大量的ES樣克隆[43]。本實(shí)驗(yàn)室用豬成纖維細(xì)胞為受體細(xì)胞誘導(dǎo)豬iPS(圖1)，在攻毒后4 d，受體細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯加快，6 d左右受體細(xì)胞會(huì)發(fā)生明顯的形態(tài)改變并出現(xiàn)極小的ES 樣克隆，至 13～15 d，克隆已長(zhǎng)到 100～200 μm 大小，可以對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。而導(dǎo)入較多的轉(zhuǎn)錄因子，如導(dǎo)入6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(OSKMNL)，同樣可以縮短克隆出現(xiàn)的時(shí)間，并提高誘導(dǎo)的效率[50-51]。此外，在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中添加甲基化酶抑制劑等小分子化合物也可以提高誘導(dǎo)的效率，縮短誘導(dǎo)時(shí)間[35]。

受體細(xì)胞在導(dǎo)入了外源基因后會(huì)明顯加快增殖速度，4～6 d之后則會(huì)發(fā)生明顯的形態(tài)改變[14]。在誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞往往會(huì)在ES樣克隆出現(xiàn)之前便已長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，這時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行傳代，盡管有報(bào)道稱誘導(dǎo)過(guò)程中傳代會(huì)影響誘導(dǎo)的效率[31]，但是不及時(shí)傳代將會(huì)導(dǎo)致受體細(xì)胞大量死亡。在連續(xù)傳代過(guò)程中，應(yīng)盡量采用Ⅳ型膠原酶進(jìn)行細(xì)胞消化，這樣可以除去傳代過(guò)程中飼養(yǎng)層的干擾[48]。

為了便于誘導(dǎo)和篩選，受體細(xì)胞可以帶上篩選標(biāo)記或報(bào)告基因。早期的iPS誘導(dǎo)均采用了抗性篩選，即將新霉素基因(neo)插入到Fbx15等胚胎干細(xì)胞特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子后面，并在誘導(dǎo)過(guò)程中添加 G418進(jìn)行篩選，最后得到 ES樣的多能性細(xì)胞[7]。后來(lái)，研究認(rèn)為iPS誘導(dǎo)是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，而多能性基因表達(dá)的開(kāi)啟需要一定的時(shí)間，在誘導(dǎo)時(shí)利用藥物篩選可能會(huì)殺死部分潛在的重編程細(xì)胞，從而降低了誘導(dǎo)效率。因此，以后都改用由Oct4或 Nanog啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因[35,39]，因?yàn)橐設(shè)ct4和Nanog多能性基因篩選得到的iPS細(xì)胞較Fbx15篩選得到的iPS細(xì)胞更接近ES細(xì)胞[11]。

從以上不同的誘導(dǎo)方法中可以看出，外源因子對(duì)受體細(xì)胞重編程的誘導(dǎo)并不依賴于外源基因?qū)κ荏w細(xì)胞基因組的整合，也不依賴于外源基因本身。只要能夠促進(jìn)受體細(xì)胞在復(fù)制過(guò)程中開(kāi)啟多能性基因的表達(dá)即可。而且受體細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程，需要大約10～15個(gè)細(xì)胞倍增時(shí)間。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒可在受體細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，因此以其為載體才有較高的誘導(dǎo)效率。而普通質(zhì)粒，尤其是蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)，對(duì)受體細(xì)胞的誘導(dǎo)作用均是瞬時(shí)性的，因此才需要反復(fù)多次的轉(zhuǎn)染或共培養(yǎng)，從而達(dá)到維持一定時(shí)間的誘導(dǎo)的目的。且誘導(dǎo)的效率也明顯要低得多，需要更長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間[32,34]。

2.2.3 iPS細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代的iPS克隆長(zhǎng)到100～200 μm時(shí)，需要對(duì)iPS克隆進(jìn)行傳代，接種到新的飼養(yǎng)層上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。早期傳代時(shí)，主要采用機(jī)械法，將克隆單個(gè)挑取，分別消化，再接種到鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔板中。等繼代克隆傳至 5～6代之后，便可以采用Ⅳ型膠原酶消化法對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。從96孔板開(kāi)始，依次逐漸放大擴(kuò)增直到接種在60 mm培養(yǎng)皿上。在得到足夠細(xì)胞量之后將其分別凍存，這樣可以保證iPS細(xì)胞遺傳背景的一致性。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)3次傳代將單個(gè)克隆的 iPS細(xì)胞傳代至六孔板中，待其長(zhǎng)滿之后便將其部分凍存，之后消化傳代的方法基本與ES細(xì)胞培養(yǎng)方法相同。挑取較好的克隆之后剩下的細(xì)胞克隆通過(guò)堿性磷酸酶(AP)染色，計(jì)數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)的效率。

如果受體細(xì)胞有GFP等篩選的報(bào)告基因，那么可以直接挑取GFP陽(yáng)性克隆。也有報(bào)道通過(guò)流式技術(shù)將誘導(dǎo)一定時(shí)間的GFP陽(yáng)性細(xì)胞先篩選富集，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)[43]。但是如果誘導(dǎo)的時(shí)間較短，有可能 GFP的報(bào)告基因要在傳代之后才慢慢呈現(xiàn)陽(yáng)性，而克隆的形態(tài)也會(huì)在傳代過(guò)程中慢慢變得更為典型[10]。

此外，誘導(dǎo)過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生較多不具有多能性的ES樣克隆，這類細(xì)胞在形態(tài)上與多能性iPS細(xì)胞相類似，同樣呈集落樣生長(zhǎng)，增殖很快。但該類細(xì)胞AP檢測(cè)大多呈陰性，內(nèi)源多能性基因表達(dá)較低，甚至不表達(dá)，而c-Myc等致瘤基因則表達(dá)很高。這可能與外源基因的導(dǎo)入和整合的隨機(jī)性有關(guān)，部分因子的缺失或表達(dá)的不一致，引起受體重編程的不完全所致[10]。

2.3 iPS細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)檢測(cè)

誘導(dǎo)得到的iPS細(xì)胞一般需要以相應(yīng)物種的ES細(xì)胞為參照標(biāo)準(zhǔn)，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)。包括其多能性細(xì)胞特異的標(biāo)志基因的表達(dá)情況，向 3個(gè)胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及 iPS明確的遺傳背景。

2.3.1 分子水平

在分子水平上，iPS細(xì)胞中導(dǎo)入的外源基因表達(dá)水平要隨著重編程的完成逐漸降低或沉默，內(nèi)源的多能性基因表達(dá)激活，基因的選擇以ES細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)志為參照。如通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、SSEA1、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81等基因的表達(dá)情況[7,13]。且此類基因在不同物種間的表達(dá)不完全相同，如小鼠的iPS一般SSEA1呈陽(yáng)性，SSEA3、SSEA4呈陰性。而人的iPS細(xì)胞則正好與之相反，SSEA1為陰性，SSEA3和SSEA4為陽(yáng)性[52]。此外，為了明確 iPS細(xì)胞的永生化能力，

還需檢測(cè)其端粒酶活性。

iPS細(xì)胞由體細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)，故還涉及檢測(cè)其遺傳背景的問(wèn)題，需通過(guò)微衛(wèi)星技術(shù)進(jìn)行指紋鑒定，要求與受體細(xì)胞一致。如受體細(xì)胞內(nèi)整合有GFP等報(bào)告基因，則亦可以作為其遺傳背景的有力證據(jù)[7]。同時(shí)，還需檢測(cè) iPS細(xì)胞中內(nèi)源的多能性基因啟動(dòng)子的甲基化水平，如Oct4和Nanog是最常用的檢測(cè)對(duì)象。這些基因的啟動(dòng)子在成體細(xì)胞中是高度甲基化的，而在誘導(dǎo)為 iPS細(xì)胞后則去甲基化，與相應(yīng)的ES細(xì)胞相一致，這也是內(nèi)源多能性基因表達(dá)開(kāi)啟的檢測(cè)指標(biāo)之一[7]。

此外，還需檢測(cè)iPS細(xì)胞整體的基因表達(dá)水平，一般采用基因芯片進(jìn)行檢測(cè)。之前的研究顯示，iPS細(xì)胞的基因表達(dá)譜與誘導(dǎo)前的受體細(xì)胞明顯不同，而與ES細(xì)胞相類似。特別是部分多能細(xì)胞中特異表達(dá)的基因，在iPS細(xì)胞中的表達(dá)幾乎與ES細(xì)胞相同[53]。但是，不同批次的iPS細(xì)胞，甚至同一批次的不同克隆之間，其基因圖譜均有一定的差異。因?yàn)槎嗄苄哉T導(dǎo)是極其復(fù)雜的重編程過(guò)程，外源基因?qū)氲碾S機(jī)性及其表達(dá)之間的差異，誘導(dǎo)時(shí)間的長(zhǎng)短，均會(huì)引起最后產(chǎn)生的 iPS克隆的具體性質(zhì)及整體基因表達(dá)譜上的差異[10]。

2.3.2 細(xì)胞水平

細(xì)胞水平需檢測(cè)的是 iPS的多向分化潛能和體外自我更新的能力。所得到的 iPS細(xì)胞首先形態(tài)上要與 ES細(xì)胞相類似，具體表現(xiàn)為細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)、集落致密且邊緣整齊、細(xì)胞形態(tài)較小、核質(zhì)比高、增殖迅速、倍增時(shí)間短、能夠長(zhǎng)期傳代。iPS細(xì)胞經(jīng) AP染色鑒定，要求呈陽(yáng)性，還需進(jìn)行多種轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞表面標(biāo)志的免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)的分選，如：Oct4、Nanog、SSEA1、SSEA3等。完全重編程的 iPS細(xì)胞應(yīng)具有體外分化潛能，能夠分化為各個(gè)胚層的不同類型的細(xì)胞，如外胚層的神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等；中胚層的肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等；內(nèi)胚層的肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。此外，還需檢測(cè) iPS細(xì)胞的核型情況，由于外源基因整合的隨機(jī)性，使誘導(dǎo)得到的 iPS細(xì)胞會(huì)有較高比例的核型異常，那些核型異常的 iPS細(xì)胞，應(yīng)予以剔除。

2.3.3 動(dòng)物水平

除了要在分子和細(xì)胞水平上對(duì) iPS細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)之外，還要求在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行其多向分化能力的檢驗(yàn)。首先要求對(duì)iPS細(xì)胞在免疫缺陷鼠(如SCID Beige 小鼠)體內(nèi)進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。將 1×106～5×106iPS細(xì)胞注射到裸鼠的皮下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)，來(lái)觀察皮下畸胎瘤形成的變化。根據(jù)動(dòng)物來(lái)源的不同，iPS細(xì)胞成瘤時(shí)間也不盡相同，如小鼠的iPS細(xì)胞約在1個(gè)月左右能成瘤，但是豬的iPS細(xì)胞需要1～3個(gè)月時(shí)間才能成瘤[54]。取出的瘤組織，經(jīng)切片檢測(cè)其是否發(fā)育出3個(gè)胚層的各種組織。同時(shí)，在條件及倫理道德允許的情況下，還應(yīng)將 iPS細(xì)胞在相應(yīng)物種上進(jìn)行嵌合體實(shí)驗(yàn)，要求后代能夠真正實(shí)現(xiàn)生殖系嵌合[11]。但與 ES細(xì)胞類似，由于倫理道德等問(wèn)題的限制，這一指標(biāo)至今仍只在小鼠上獲得成功。最近有研究報(bào)道，小鼠 iPS細(xì)胞通過(guò)與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由 iPS細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的小鼠，這充分說(shuō)明了 iPS細(xì)胞具有發(fā)育為完整個(gè)體的能力[16]。

3 展望

iPS技術(shù)的誕生將干細(xì)胞研究推進(jìn)到了一個(gè)新的高度，極大豐富了干細(xì)胞的研究?jī)?nèi)容。在過(guò)去 3年里，iPS技術(shù)發(fā)展迅速，先后已在小鼠、人、獼猴、大鼠和豬中取得了成功。而且早期 iPS技術(shù)上遇到的難題和困擾，如病毒載體、致瘤基因、誘導(dǎo)效率、iPS全能性等都一一得到了解決。特別是在小鼠和人上的 iPS研究日益深入，誘導(dǎo)的方法也不斷得到優(yōu)化，動(dòng)物機(jī)體組織的各種細(xì)胞均可被誘導(dǎo)為 iPS細(xì)胞。由于iPS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞相類似的特性和功能，盡管還不能完全代替ES細(xì)胞，但是其成功地繞開(kāi)了免疫排斥問(wèn)題和倫理道德問(wèn)題的困擾，是再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞，也可作為臨床藥物篩選細(xì)胞模型和人類疾病治療細(xì)胞模型。此外，由于 iPS細(xì)胞可在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)，是轉(zhuǎn)基因技術(shù)中理想的種子細(xì)胞，用作基因打靶受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。特別是對(duì)于至今仍沒(méi)有ES細(xì)胞建系的物種，iPS細(xì)胞有可能成為其ES的代替細(xì)胞應(yīng)用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)際。

當(dāng)然，目前iPS技術(shù)還不是十分完善，對(duì)于誘導(dǎo)的機(jī)理也沒(méi)有完全研究清楚，尤其是誘導(dǎo)過(guò)程中產(chǎn)生的大量類 iPS細(xì)胞或不完全重編程細(xì)胞的干擾，使得真正具有全能性的iPS難以被很快篩選得到。但是相信隨著研究的不斷深入，iPS技術(shù)將會(huì)更加成熟，iPS細(xì)胞將會(huì)在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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Induction and characterization of induced pluripotent stem(iPS)cells: a review

De Cheng, Lei Lei, Zhijuan Lu, Zhen Li, and Huayan Wang
Shaanxi Key Laboratory of Agricultural Molecular Biology, Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China

Received:October 29, 2009;Accepted:March 2, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30871786), High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2008AA101005), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB941002).

Corresponding author:Huayan Wang.Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30871786)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2008AA101005)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2009CB941002)資助。