李安民

河南商丘市第五人民醫(yī)院 商丘 476000

循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cell,CEC)是目前在活體內(nèi)評價血管損傷的唯一的特異而直接的指標(biāo)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。我們對60例ACI患者血清CEC進(jìn)行檢測,探討其在缺血性腦血管病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料全部病例均系2008～2010年首次發(fā)病2周內(nèi)在我院住院的ACI患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)1996年全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂制定的標(biāo)準(zhǔn),所有患均經(jīng)CT或MRI證實(shí)。共60例,其中男 39例,女21例;年齡32～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)有：(1)近2個月內(nèi)有感染史;(2)伴免疫性疾病;(3)伴血液系統(tǒng)疾病;(4)有嚴(yán)重的心、肝、腎疾病;(5)入院后有明顯感染癥狀者;(6)伴有惡性腫瘤。對照組為年齡、性別相匹配的健康者,共20例,其中男14例,女6例;年齡34～79歲。按梗死灶大小進(jìn)行分組,大梗死灶組最大梗死直徑＞4.0 cm,中梗死灶組梗死直徑1.5～4.0 cm,小梗死灶組最大梗死直徑＜1.5 cm。

1.2方法ACI患者入院后,急性期患者于次日清晨,恢復(fù)期患者于第4周空腹取肘靜脈血10 mL。健康對照組也按同樣方法取肘靜脈血 10 mL,取其中2 mL,1500 r/min,離心10 min,分離血清后-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?Hladovec等[2]建立的Percoll密度梯度快速一步分離法分離和計(jì)數(shù)CEC,分離步驟為：(1)將3.0 mL抗凝血以等量生理鹽水稀釋;(2)加人2.0 mL Percoll分離液后離心,取Percoll界面以上液體作為上層以及Percoll層液體1.0 mL作為中層;(3)將上層液體再次離心(2100 r/min,20 min),棄管中上清,加生理鹽水0.5 mL。混勻后一起鏡檢;(4)在Olympus顯微鏡下計(jì)數(shù)。

用Iwata等[3]免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行鑒定,證實(shí)該細(xì)胞是CEC。具體操作步驟如下：(1)取上清液少許涂在玻片上,干燥后用甲醇固定5 min,用PBS漂洗3次,干后滴加兔抗人Ⅷ因子血清,置于37℃中孵育30 min;(2)再次用PBS漂洗3次,干后滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光抗體,方法同上;(3)干燥后滴加緩沖甘油,置Olympus VANOX多功能顯微鏡下觀察。由于本實(shí)驗(yàn)中因去除血小板等血細(xì)胞影響,所以鏡下所見的免疫熒光細(xì)胞即CEC。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以(s)表示,采用單因素方差分析及直線相關(guān)分析,由SPSS 10.0軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 2組血清CEC水平比較ACI患者急性期和恢復(fù)期血清CEC計(jì)數(shù)均高于正常對照組(P＜0.01),急性期血清CEC則高于恢復(fù)期(P＜0.01)。見表1。

表1 2組血清CEC水平比較

2.2不同面積梗死灶的ACI患者血清CEC水平比較大灶組血清CEC明顯高于中灶組(P＜0.01),中灶組血清CEC顯高于小灶組(P＜0.01)。見表2。

表2 ACI患者不同梗死灶的CEC水平比較

3 討論

CEC是指在生理或病理?xiàng)l件下從循環(huán)血中獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞。CEC形態(tài)多樣,大多呈不規(guī)則多邊形,形狀呈無核、皺縮、折疊或扭曲狀[4]。楊映波等[5]的研究表明,從臍靜脈和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了EC,這種內(nèi)皮細(xì)胞酷似 CEC,表明CEC可能來自正常脫落的內(nèi)皮細(xì)胞。在受到機(jī)械、化學(xué)和免疫等因素作用時,EC結(jié)構(gòu)和功能均會發(fā)生改變,從血管內(nèi)皮細(xì)胞(VCE)到CEC大致形變的過程為一漸進(jìn)過程,依次為胞質(zhì)腫脹、空泡形成、細(xì)胞變圓、胞膜破裂及胞核脫出等。如缺血、缺氧、氧自由基均可損傷 EC致CEC增多,另外,腫瘤壞死因子、創(chuàng)傷等均可引起CEC的增加。

正常生理情況下CEC數(shù)值是相對穩(wěn)定的,這是由于血管壁新陳代謝過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落至血液中,其脫落速度是恒定的,而在機(jī)體受到某些理化因素的刺激,這使得血管受到損傷,外周血液中內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量就會增多。沙志一等[6]研究發(fā)現(xiàn),人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HVEC)經(jīng)腫瘤壞死因子(TNF)作用后72h后明顯拉長、腫脹,通過透射電鏡觀察可見細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、變性,次級溶酶體顯著增多。這就提示TNF對HVEC有損傷作用。新近研究表明[7],腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的幾乎所有功能都會受缺血的影響,缺血不僅影響血-腦脊液屏障,而且還產(chǎn)生一些對大腦有毒的物質(zhì)。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害既是腦缺血損害的結(jié)果,又可進(jìn)一步加重缺血性腦損害的程度。

本研究發(fā)現(xiàn)ACI患者中CEC的含量明顯高于正常對照組。這一點(diǎn)就提示血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害與缺血性疾病呈顯性相關(guān),并且與缺血神經(jīng)元的損害的程度具有顯著相關(guān)性。因此,如何保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,防止血管內(nèi)皮細(xì)胞的脫落的研究,將有助于ACI患者的治療,尤其是早期預(yù)防。

總之,ACI時外周血CEC數(shù)量的升高不能忽視。保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞研究,對缺血性腦血管病的防治將具有重要意義。

[1]Hladovec J,Prerovsky I.Endothelial lesion in hypertension[J].Cor Vasa,1989,31：51-54.

[2]Hladovec J,Rossmann P.Circulating endothelial cells isolated together with platelets and the experimental modification of their counts in rats[J].Thrombosis Research,1973,3：665-674.

[3]Iwata Y,Kuzuya F,Hayakawa M,et al.Circulating endothelial cells fail to induce cerebral infarction in rabbits[J].Stroke,1986,17：506-509.

[4]Dignat-George F,Sampol J.circuiafing endothelial cells in vasculer disorders：new insights into an old concept[J].Eur J Haematol,2000,65：215-220.

[5]楊映波,王正國.創(chuàng)傷使血內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)理的實(shí)驗(yàn)和臨床研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1992,14：102-103.

[6]沙志一,金惠銘.腫瘤壞死因子對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[J].中國病理生理雜志,1995,11(5)：455-459.

[7]Betz AL.Alterations in cerebral endothelial cell function in ischemia[J].Adv Neurol,1996,71：301-311.