何忠梅,白 冰,金 穎,祝洪艷,闞俊明,宋 宇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130116;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院;3.吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司;4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

薯蕷皂苷元(Diosgenin,Dio)是從我國(guó)特有的薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino中分離得到的一種植物甾體化合物,具有降血脂、降血糖、促進(jìn)膽汁分泌、抗心肌缺血、抗風(fēng)濕、抗炎等作用,而它的抗腫瘤作用[1,2]更是引起了研究者的極大關(guān)注。我們課題組曾報(bào)道Dio對(duì)小鼠肉瘤S180、肝癌腹水型HepA、小鼠宮頸癌U14和艾氏腹水癌EAC的體內(nèi)抗腫瘤作用,并觀察了離體條件下Dio對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、小鼠纖維細(xì)胞L929、黑色素瘤細(xì)胞A375-S2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胃低分化粘液腺癌MGC-803等細(xì)胞株的作用[3-5]。但其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的作用情況及其作用機(jī)制尚無(wú)相關(guān)報(bào)道,本研究考察了Dio對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)于吉林省腫瘤醫(yī)院。RPMI-1640培養(yǎng)基,薯蕷皂苷元,二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清為長(zhǎng)春生物制品研究所產(chǎn)品。胰蛋白酶為日本生產(chǎn)上海化學(xué)試劑廠分裝。5-氟尿嘧啶(5-FU,批號(hào)20090612)購(gòu)于上海銳聰科技發(fā)展有限公司(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)。PBS、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的影響 將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板(100 μ l/孔)中,待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μ l不同濃度的薯蕷皂苷元培養(yǎng)液,使最終濃度分別為2、4 、8 、16、32 、64、128 μ g?ml-1,陽(yáng)性對(duì)照組加入5-氟尿嘧啶,終濃度為20 μ g?ml-1,陰性對(duì)照組加入含0.5%DMSO的培養(yǎng)液100 μ l/孔,空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液,每組各設(shè)4個(gè)平行孔。37℃,分別培養(yǎng) 24、48、72 h,加入5 mg/ml MTT 20 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入DMSO 150 μ l,混勻,酶標(biāo)儀(λ=570 nm)測(cè)定吸光度(A570),按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率[6]:腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-A570(實(shí)驗(yàn)組)/A570(對(duì)照組)]×100%。

1.4 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度IC50的計(jì)算 直線回歸法[7]:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度有對(duì)數(shù)關(guān)系時(shí),以藥物的對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo),求出直線回歸方程,根據(jù)該方程計(jì)算出IC50。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響 SGC-7901細(xì)胞單層接種在60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中,細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè),培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的薯蕷皂苷元培養(yǎng)液 ,使最終濃度分別為 8、16、32、64 μ g?ml-1,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,每組設(shè)4個(gè)平行,分別培養(yǎng)0、12、24 、36 h 后,收集貼壁及懸浮細(xì)胞,1 500 r?min-1離心 5 min,PBS(0.01 mol?L-1,Ph7.4)洗 1次 ,70%冰乙醇-20℃固定18 h,用冷PBS洗2次,1 500 r?min-1離心 5 min,棄上清,懸于 0.5 ml含 50 g?L-1PI,100 mg?L-1RNase A 的染液中,4℃避光染色30 min。500 mm篩網(wǎng)過(guò)濾后,用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國(guó)BD公司)測(cè)定,計(jì)算機(jī)軟件處理,得出各細(xì)胞周期及凋亡細(xì)胞百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)間比較用F檢驗(yàn),兩組間均數(shù)差異以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的抑制作用 Dio對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,且呈明顯的時(shí)-效和量-效關(guān)系。隨著Dio濃度的增加,作用時(shí)間的延長(zhǎng),其抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的能力也隨之增強(qiáng)。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì),Dio對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度成對(duì)數(shù)關(guān)系,故采用直線回歸方程法計(jì)算IC50值,Dio作用SGC-7901 細(xì)胞 24、48、72 h IC50值分別為62.90、31.83 和 18.21 μ g?ml-1。當(dāng) Dio 達(dá)到較高濃度(32、64 μ g?ml-1)時(shí),對(duì) SGC-7901 細(xì)胞的增殖抑制作用在48、72 h已十分接近。因此,48 h高濃度Dio已基本發(fā)揮最大效能,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901增殖的抑制作用(±s,n=4)

表1 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901增殖的抑制作用(±s,n=4)

與陰性對(duì)照組比較*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

組別 濃度(μ g?ml-1)作用24 h平均A570(抑制率%)作用48 h平均A570(抑制率%)作用72 h平均A570(抑制率%)陰性對(duì)照組 0 0.739±0.016 0.813±0.013 0.935±0.011 5-FU 20 0.398±0.008***(46.08) 0.266±0.010***(67.16) 0.132±0.007***(85.85)薯蕷皂苷元 2 0.699±0.012(5.41) 0.764±0.013(6.03) 0.872±0.008*(6.77)4 0.685±0.007*(7.31) 0.732±0.013*(9.96) 0.830±0.012*(11.24)8 0.616±0.011*(16.64) 0.663±0.012*(18.45) 0.751±0.008**(19.64)16 0.529±0.010**(28.42) 0.537±0.009**(33.94) 0.610±0.007***(34.73)32 0.431±0.016**(41.68) 0.439±0.011**(46.00) 0.503±0.010***(46.19)64 0.210±0.009***(71.58) 0.199±0.010***(75.52) 0.224±0.006***(76.02)128 0.163±0.009***(77.94) 0.151±0.009***(81.43) 0.164±0.005***(82.40)

2.2 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期及凋亡的影響 應(yīng)用FACS ModFit LT軟件對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,使RCS(統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo),用來(lái)反映所選定的模式與標(biāo)本的擬合程度)小于等于5.0,分析得到Dio對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞作用的細(xì)胞周期時(shí)相和凋亡率數(shù)據(jù)。細(xì)胞周期數(shù)據(jù)顯示,Dio在較低濃度 8和16 μ g?ml-1時(shí),隨著作用時(shí)間由12-24-36 h延長(zhǎng),對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期(G0/G1,S,G2/M)均沒(méi)有影響;當(dāng)Dio濃度增加到32和64 μ g?ml-1時(shí),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)S期細(xì)胞略有增加,G2/M期細(xì)胞略有減少,但與陰性對(duì)照組比較差異不顯著。凋亡數(shù)據(jù)表明,隨著作用濃度由8-16-32-64 μ g?ml-1的不斷增加 ,隨著作用時(shí)間由 12-24-36 h的不斷延長(zhǎng),Dio誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率不斷增加,呈現(xiàn)較好的時(shí)間-劑量依賴性。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌 SGC-7901細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=4)

表2 薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌 SGC-7901細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=4)

與陰性對(duì)照組比較*P＜0.05,**P＜0.01

作用時(shí)間(h) 薯蕷皂苷元濃度(μ g?ml-1) G0/G1期(%) G2/M 期(%) S期(%) AP(%)12 陰性對(duì)照 21.32±2.21 34.67±3.83 42.28±6.32 1.48±0.62 8 23.14±3.34 36.93±4.05 43.22±5.22 7.69±1.23 16 22.26±5.65 34.75±3.27 41.45±7.81 12.84±0.84*32 20.38±4.89 35.81±6.48 40.34±6.12 27.12±2.32**64 19.57±6.48 33.20±5.39 41.27±5.38 30.08±1.97**24 陰性對(duì)照 16.28±1.93 52.03±7.69 29.28±2.46 2.31±0.85 8 17.36±3.22 53.96±4.62 30.92±5.25 10.43±1.69*16 15.84±2.18 51.37±5.61 29.32±4.66 15.69±1.33*32 16.32±2.97 46.69±4.23 34.62±5.44 31.23±2.77**64 17.68±2.21 44.12±5.21 38.02±4.97 38.83±4.74**36 陰性對(duì)照 31.63±5.27 35.82±4.24 28.29±3.99 4.28±1.06 8 32.13±4.38 36.10±4.12 27.34±5.18 12.39±1.02*16 31.34±5.01 35.65±3.98 28.67±4.12 18.81±1.24*32 33.26±4.58 30.91±9.21 33.82±5.39 37.21±2.94**64 32.23±5.99 24.22±10.89 39.23±4.28 43.78±3.99**

3 討論

我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí),薯蕷皂苷經(jīng)口服后被腸內(nèi)菌代謝為Dio吸收入血[8],Dio具有很好的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用[3-5],更重要的一點(diǎn)是Dio無(wú)毒副作用,因此將Dio開(kāi)發(fā)為臨床抗腫瘤藥物有很大的發(fā)展前景。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明Dio吸收入血后主要分布在胃腸壁,因此本實(shí)驗(yàn)探討Dio對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制作用,并考察其對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。

MTT結(jié)果顯示,Dio體外可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖,并呈時(shí)間-劑量依賴性,作用 24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為62.90、31.83和18.21 μ g?ml-1;流式細(xì)胞檢測(cè)表明,8 、16、32、64 μ g?ml-1的Dio分別作用 SGC-7901 細(xì)胞 12、24、36 h,對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有明顯影響,但能明顯誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡,同樣具有顯著的時(shí)間-劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)提供了Dio抑制SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制,為Dio用于臨床治療胃癌提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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