郭威早,佟 倩,曹立新,李 琳

(1.北京大學(xué)航天中心醫(yī)院高干二科,北京100049;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科;3.安徽省六安市婦幼保健院檢驗(yàn)科;4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院心內(nèi)科)

微小RNA(microRNA,簡稱miRNA)是人和其他生物體中內(nèi)源性的短鏈RNA分子,長度為22核苷酸左右,其通過與相關(guān)的信使RNA(mRNA)結(jié)合抑制其翻譯或誘發(fā)其降解[1]。研究顯示,人類基因的30%受miRNA調(diào)節(jié),此外miRNA的調(diào)節(jié)能力極強(qiáng),單一的miRNA可以調(diào)控多達(dá)100-200個(gè)基因[2]。大量的研究證明,miRNA與心血管具有非常緊密的聯(lián)系,這種聯(lián)系的表現(xiàn)極為廣泛,包括心臟的發(fā)育、損傷、修復(fù),也包括各種心血管疾病,miRNA業(yè)已成為冠心病等心血管疾病分子病理學(xué)的研究熱點(diǎn)[3]。

C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,簡稱CRP)是心血管疾病中最具代表性的信號分子之一,也是現(xiàn)代心血管疾病研究的焦點(diǎn)之一。離體和在體的研究顯示,CRP能夠識別宿主體內(nèi)特定的外來病源以及受損的細(xì)胞,與血液中的體液及細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制相互作用,從而啟動(dòng)對病源和受損細(xì)胞的清除[4]。由此可見,CRP既具有識別功能,又兼?zhèn)湫?yīng)能力,其重要性非同一般。本研究將微小RNA和C反應(yīng)蛋白結(jié)合起來,探討miRNA對CRP的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)由美國ATCC公司購買,獲得細(xì)胞株之后,采用 DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清,在 5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)。一輪培養(yǎng) 3天,然后按1∶2-4的比例分盤繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞脫壁收集采用0.25%(重量/體積)胰蛋白酶合并0.53 mM EDTA溶液處理10分鐘。

1.2 調(diào)控CRP之miRNA的選擇 miRNA與調(diào)控靶基因之間不存在精確的對應(yīng)關(guān)系,一個(gè)miRNA可以調(diào)控?cái)?shù)十個(gè)甚至更多的基因,同時(shí),一個(gè)基因也可以被數(shù)十個(gè)乃至更多的miRNA調(diào)控。因此,選擇一個(gè)基因的調(diào)控miRNA需要多層次,多角度的分析。在本研究中,我們首先根據(jù)國際通行的理論預(yù)測方法[5]對大鼠C反應(yīng)蛋白基因3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)進(jìn)行推測,以“種子區(qū)”(seed)完全匹配為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得21個(gè)候選miRNA,對大量的既往研究報(bào)道進(jìn)行了對比分析后,最后鎖定了miR-132。miR-132除了根據(jù)理論推測調(diào)控CRP之外,研究顯示,其在機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和白細(xì)胞介素-8(il-8)的調(diào)節(jié)中具有重要作用[6]。應(yīng)激反應(yīng)和il-8均與心血管疾病有密切的聯(lián)系,由此進(jìn)一步佐證了miR-132極有可能介入心血管疾病的調(diào)節(jié)。

1.3 miR-132的增強(qiáng)和抑制 增強(qiáng)劑和抑制劑均從美國Ambion公司(現(xiàn)為美國ABI公司所屬)。PremiR miRNA前體為合成的雙鏈RNA分子(針對miR-132的產(chǎn)品號為PM10166),因模擬自然產(chǎn)生的miR-132的功能而產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng);Anti-miR miRNA抑制劑為化學(xué)修飾的單鏈核酸(針對miR-132的產(chǎn)品號為AM10166),可以特異地結(jié)合miRNA而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。此外Pre-miR miRNA前體分子陰性對照1號(產(chǎn)品號:AM17110)和Anti-miR miRNA抑制劑陰性對照1號(產(chǎn)品號:AM17010)分別作為增強(qiáng)劑和抑制劑的陰性對照。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為了將miR-132增強(qiáng)劑、抑制劑及其相應(yīng)陰性對照導(dǎo)入培養(yǎng)的H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)采用美國Neuromics公司iFect試劑盒,操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。預(yù)實(shí)驗(yàn)采用了4個(gè)濃度,分別為10、20、30及40 nmol/L,正式實(shí)驗(yàn)按最小有效劑量原則(盡可能減少轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒副作用)采用20 nmol/L。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 蛋白免疫印跡雜交 通過1000 g,10 min離心收集培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于1 ml冰冷的裂解緩沖液,轉(zhuǎn)移至2.0 ml Eppendorf離心管中。裂解緩沖液包括:20 mM Tris-HCl(pH7.5),1 mM EDTA,1 mM EGTA,2.5 mM焦磷酸鈉,1%Triton X-100,150 mM氯化鈉,1 mM β-磷酸甘油。以下成分在使用前加入:5 mM二硫蘇糖醇,1%磷酸酶抑制劑Cocktail I,1%磷酸酶抑制劑Cocktail II,10%磷酸酶抑制劑Cocktail(磷酸酶抑制劑購自Sigma公司)。樣本通過Virtis超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲剪切(設(shè)置2.0,處理1 s×10次),然后,樣本在14 000 g離心 5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進(jìn)行。免疫印跡用處在線性區(qū)間的蛋白量進(jìn)行。等量的蛋白加入到8-16%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水,0.1%吐溫-20,5%脫脂牛奶。CRP抗體(美國Abcam公司)根據(jù)制造者的建議稀釋并根據(jù)初始測試調(diào)整,正式實(shí)驗(yàn)中采用1∶200的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗兔抗體。β-肌動(dòng)蛋白抗體(美國Cell Signaling公司)用作上樣對照。免疫復(fù)合物用ECL加強(qiáng)型試劑盒(美國Amersham公司)探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene G:BOX凝膠建檔及分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)用SPSS 11.5版進(jìn)行。資料收集,一般統(tǒng)計(jì)計(jì)算(均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤等)以及統(tǒng)計(jì)作圖采用微軟公司MS-Excel(version 2000)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)培養(yǎng) 在本研究所設(shè)定的培養(yǎng)條件下,大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)生長狀況正常,無異常分化,形態(tài)符合大鼠細(xì)胞的一般組織學(xué)特征(見圖1)。

圖1 培養(yǎng)中的大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)(倒置顯微鏡 100×觀察)

2.2 miR-132的增強(qiáng)和抑制對CRP蛋白表達(dá)水平的影響 培養(yǎng)中的大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)在運(yùn)用增強(qiáng)劑Pre-miR-132處理48 h后,CRP蛋白水平與陰性對照相比,出現(xiàn)了明顯的下降(t-檢驗(yàn),P=0.013 21)。與此同時(shí),大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)在運(yùn)用抑制劑Anti-miR-132處理48小時(shí)后,CRP蛋白水平與陰性對照相比,出現(xiàn)了明顯的上升(t-檢驗(yàn),P=0.012 40)。作為本實(shí)驗(yàn)蛋白印跡雜交的上樣內(nèi)參照,β-肌動(dòng)蛋白的水平?jīng)]有顯著差異。miR-132的增強(qiáng)和抑制實(shí)驗(yàn)采用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行,每對處理-對照均在同一細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行,確保培養(yǎng)和處理?xiàng)l件的完全一致。miR-132增強(qiáng)和抑制實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了6對比較(n=6)。miR-132的增強(qiáng)和抑制結(jié)果詳情參見圖2。

圖2 miR-132增強(qiáng)劑和抑制劑對CRP蛋白質(zhì)水平的影響

3 討論

在冠心病的病理學(xué)說中,C反應(yīng)蛋白居于重要的核心地位[7],國內(nèi)外均對這一標(biāo)志性蛋白分子進(jìn)行了大量的研究。迄今為止的研究絕大多數(shù)CRP本身的量化測定以及與疾病的相關(guān),很少涉及CRP背后的分子調(diào)控機(jī)制。心血管病具有非常復(fù)雜的背景,在CRP的背后存在眾多復(fù)雜的因素及這些因素之間的相互作用,這種復(fù)雜的背景在很大程度上阻礙了對CRP分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。近年來關(guān)于miRNA認(rèn)識的深入為心血管疾病的分子機(jī)制研究提供了新的途徑,也為重新認(rèn)識CRP的基因調(diào)控提供了新的手段。

本研究以大鼠心肌細(xì)胞為研究對象,在具有潛在調(diào)節(jié)功能的miRNA功能增強(qiáng)和抑制的條件下觀察CRP蛋白的水平,旨在建立miRNA與CRP基因功能水平二者之間的關(guān)系。本研究經(jīng)過系列的分析篩選,通過理論推測和參考研究報(bào)道選擇了miR-132。研究顯示,miR-132可以調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),并可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-8的水平[6]。值得關(guān)注的是,應(yīng)激被大量的研究證實(shí)為冠心病的危險(xiǎn)因素[8,9],而IL-8與冠心病的聯(lián)系也具有明確的研究支持[10]。

我們的研究觀察在很大程度上證實(shí)了理論上的預(yù)計(jì)。采用miR-132增強(qiáng)處理可以顯著抑制心肌細(xì)胞CRP蛋白水平,說明miR-132對CRP基因的功能水平具有抑制調(diào)節(jié)功能。與此相對應(yīng),采用miR-132抑制處理可以顯著提高心肌細(xì)胞CRP蛋白水平,說明miR-132功能部分或全部喪失的情況下,CRP的基因功能水平可以大幅度的提高。研究提示,在心血管疾病的分子病理學(xué)方面,miRNA是一個(gè)不可忽視的重要調(diào)控因素。

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