孫 亞 娟， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum Ait)是一種極具開發(fā)潛力的中草藥?；⒀廴f年青中所包含的虎眼萬年青皂苷屬于甾體皂苷，甾體皂苷具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，如抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等?；⒀廴f年青皂苷OSW-1，是一種具有極強(qiáng)抗癌活性的?；戠尥檐?，對肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活性。體外抗p338淋巴細(xì)胞白血病活性結(jié)果表明，OSW-1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍[1]，而且對正常細(xì)胞沒有毒性。迄今為止，國內(nèi)對虎眼萬年青的研究，主要集中在多糖的提取及藥理活性[2-4]和組織培養(yǎng)方向[5]，對于虎眼萬年青皂苷的分離提取的報道很少。本實(shí)驗(yàn)室肖沖等[6]已從虎眼萬年青中提取了虎眼萬年青皂苷，由于單體皂苷作用不同，所以有必要制成單體皂苷制劑。本實(shí)驗(yàn)以分離得到虎眼萬年青皂苷單體組分為首要目的，用硅膠柱層析法嘗試分離虎眼萬年青皂苷單體組分。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

虎眼萬年青總皂苷，實(shí)驗(yàn)室自制；硅膠，青島海洋化工廠；薄層層析板(TLC)，德國Merck公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛郎儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 薄層層析(TLC)

本實(shí)驗(yàn)所用薄層層析板由德國Merck公司生產(chǎn)。用微量取樣器取一定量樣品點(diǎn)于薄層層析板起始線上，電吹風(fēng)吹干，置于放好展開劑的展開缸中展開后，吹干溶劑，10% H2SO4溶液顯色，得TLC圖譜。所用展開劑為：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7.0∶3.0∶0.5。

1.2.2 減壓硅膠柱層析

制備樣品膠：稱取一定量的虎眼萬年青總皂苷放入瓷碗中，加入適量的甲醇，充分溶解后，與1.5倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠混合，攪拌均勻，60 ℃水浴鍋上加熱，待樣品被硅膠吸附，溶劑充分揮發(fā)干燥后，磨成均勻的粉末，樣品膠制備完成。

裝柱：先用一小塊脫脂棉堵住柱底，然后取16倍樣品質(zhì)量的300～400目硅膠(分離膠)裝柱，保持水平，抽真空壓實(shí)，然后在其上面裝入薄薄一層80～100目的硅膠，再裝入干燥好的樣品膠，最后在樣品膠上面鋪上一層脫脂棉，抽真空壓實(shí)。

硅膠柱裝好后，先用純氯仿通柱子，再用氯仿-甲醇的混合溶劑進(jìn)行洗脫，每次大約100 mL，分別收集洗脫液。用薄層層析法跟蹤檢測整個洗脫過程，根據(jù)硅膠板上顯示的結(jié)果，把具有相同組分的洗脫液收集在一起，濃縮得固體產(chǎn)物。

本實(shí)驗(yàn)虎眼萬年青總皂苷用量為5 g，洗脫液比例為V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1。

1.2.3 超高壓液相色譜檢測虎眼萬年青皂苷

實(shí)驗(yàn)所用為美國Waters Acquity UPLC色譜儀；C18色譜柱為waters 50 mm×2.1 mm，1.7 μm；進(jìn)樣量為3 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水。流動相比例為：初始，A為10%，B為90%；3 min時，A為60%，B為40%；5.5～7 min時，A為100%，B為0。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷

稱取虎眼萬年青總皂苷5 g，硅膠柱層析方法分離。由圖1可知，分離產(chǎn)物按照極性由小到大順序流出，瓶號25～28，48～56，72～77，86～89，97～122為單點(diǎn)，單獨(dú)收集，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E加以區(qū)分。

圖1 虎眼萬年青總皂苷硅膠柱分離成分TLC檢測結(jié)果Fig.1 TLC for Ornithogalum caudaside sample separated by silica gel column chromatograph

將所得各單體皂苷組分單獨(dú)收集，濃縮后稱重，并計(jì)算得率，對比如表1。

表1 各組分洗脫分離收集表Tab.1 Yield of product

2.2 虎眼萬年青皂苷單體的檢測

UPLC檢測虎眼萬年青總皂苷及分離所得單體。精密稱取各樣品1 mg，分別溶于1 mL乙腈，完全溶解過0.45 μm微孔濾膜，取濾液。其UPLC檢測圖譜如圖2～7所示。

由虎眼萬年青總皂苷的色譜圖可以看出，虎眼萬年青總皂苷中含有很多組分，共有12個峰，其中D、E組分的峰值較高，峰面積也相對較大，含量相對較高，比較各色譜圖，可以看出，本次硅膠柱層析對D、E組分的純化效果較好。各樣品保留時間及峰面積所占比例情況見表2。

圖2 虎眼萬年青總皂苷色圖譜Fig.2 Chromatogram of caudaside

圖3 A組分色譜圖Fig.3 Chromatogram of A sample

圖4 B組分色譜圖Fig.4 Chromatogram of B sample

圖5 C組分色譜圖Fig.5 Chromatogram of C sample

圖6 D組分色譜圖Fig.6 Chromatogram of D sample

圖7 E組分色譜圖Fig.7 Chromatogram of E sample

表2 各組分色譜分析對比Tab.2 Analysis for chromatogram of product

3 結(jié) 論

硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷樣品5 g，TLC跟蹤檢測，按照極性由小到大依次得到5種虎眼萬年青皂苷單體。得率分別為2.6%、2.6%、3.6%、5.4%、12.6%。超高壓液相色譜檢測各樣品，虎眼萬年青總皂苷中D、E組分的含量相對較高，本次硅膠柱層析對D、E組分的分離效果相對較好。采用硅膠柱層析的方法可以初步達(dá)到分離純化虎眼萬年青總皂苷的目的。本實(shí)驗(yàn)對今后研究虎眼萬年青單體皂苷的分子結(jié)構(gòu)及其藥理活性打下一定的基礎(chǔ)。

[1] MIMAKI Y, KURODA M, KAMEYAMA A, et al. Cholestane glycosides from Ornithogalum saundersiae and their potent cytotoxic activity on various malignant tumor cells[J]. Tennen Yuki Kagohutsu Toronkai Koen Yoshishu, 1996, 38:313-318.

[2] 石磊,李娟,劉志強(qiáng),等. 虎眼萬年青多糖增強(qiáng)非特異性免疫和體液免疫的作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2002, 28(3):232-234.

[3] 石磊,段秀梅,胡夢林,等. 虎眼萬年青多糖對小鼠T細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-2mRNA表達(dá)的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2004, 30(5):678-680.

[4] 石磊,譚巖. 虎眼萬年青多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2002, 18(11):799-803.

[5] TANG Yuping, YU Biao. The chemical constituents from bulbs of Ornithogalum caudatum[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2001, 10(4): 26-28.

[6] 肖沖,魚紅閃. 虎眼萬年青皂苷的分離提取[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2006, 25(2):93-95.

(XIAO Chong, YU Hong-shan. Separation and extraction of caudaside[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2): 93-95.)