陳 嬌 嬌， 孫 亞 娟， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參中含量較高的人參皂苷一般是多糖基的，如Rb1、Rc、Re等；低糖基的人參皂苷一般為稀有人參皂苷，如C-K、Rh2、Rh3、Rg4、Rg5等[1]。其中稀有人參皂苷具有重要的生物學(xué)功能，可提高其在腸道內(nèi)的吸收率。稀有人參皂苷C-K等與人參皂苷Rb1都屬于四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型二醇類皂苷，具有相同的母環(huán)結(jié)構(gòu)，差別僅在側(cè)鏈糖基不同[2]。目前，國內(nèi)外有目的地改變多糖基人參皂苷的糖基進(jìn)而制備稀有人參皂苷方面的報(bào)道相對較少[3]。本課題組通過多年研究，從微生物中篩選出Absidiasp.G8r產(chǎn)人參皂苷糖苷酶(Glc8)和Absidiasp.G4r產(chǎn)人參皂苷糖苷酶(Glc4)，這兩種酶可將人參皂苷Rb1水解生成人參皂苷F2。本文將這兩種不同菌種所產(chǎn)的兩種人參皂苷糖苷酶進(jìn)行分離純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)以及酶反應(yīng)特性進(jìn)行詳細(xì)的比較研究，為酶法水解人參皂苷，制備高活性的稀有人參皂苷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種Absidiasp.G8r、Absidiasp.G4r ，大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院菌種保藏所提供；人參皂苷Rb1、Rd、F2等標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制；薄層層析板silica gel 60-F254，德國Merk公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

人參液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：稱取人參100 g粉碎倒入燒杯中并加入300 mL水，文火加熱，熬煮7 h，注意補(bǔ)水。冷卻后用紗布過濾，濾液于7 000 r/min下離心10 min，上清為人參浸出液，補(bǔ)水至200 mL制成人參浸出液備用。在12 mL的人參浸出液中加入48 mL 10°的麥芽汁，再加40 mL水補(bǔ)齊到100 mL，制成Glc8和Glc4液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃濕熱滅菌后待用。

1.2.2 微生物發(fā)酵及粗酶液的制備

將菌種Absidiasp.G8r和Absidiasp.G4r分別接種于滅菌后的培養(yǎng)基中，置于全溫振蕩器內(nèi)，在30 ℃，160 r/min的條件下培養(yǎng)3～4 d。

將發(fā)酵培養(yǎng)好的發(fā)酵液，用8 000 r/min高速冷凍離心機(jī)離心15 min，收集上清液；在磁力攪拌條件下，緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至75%飽和度；在4 ℃下靜置1～2 h。再用高速冷凍離心機(jī)在13 000 r/min下離心20 min，收集蛋白質(zhì)沉淀。沉淀用10 mL 20 mmol/L pH 5.0醋酸緩沖液溶解，裝入透析袋，用相同緩沖液透析24 h，約每2 h更換一次緩沖液。透析結(jié)束后取出液體，在13 000 r/min下冷凍離心10 min，所得上清液即為粗酶液，放入冰箱保存待用。

1.2.3 酶液的提純

分別取兩種粗酶液用DEAE-Cellulose DE52離子交換柱進(jìn)行分離提純[4]。粗酶液上柱后先用20 mmol/L pH 5.0 HAc-NaAc緩沖液洗脫，然后用由此緩沖液配制的60、90、120、150、180、240 mmol/L的KCl溶液各50 mL進(jìn)行梯度洗脫，每3 min收集1管，每管收集3 mL，紫外分光光度計(jì)280 nm下測定各管的紫外吸光值(OD)，確定其蛋白含量。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定酶蛋白的分子質(zhì)量

樣品經(jīng)處理后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法[5]測定酶的純度與分子質(zhì)量。所選用標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：磷酸酶b(97.2 ku)、牛血清蛋白(66.4 ku)、卵清蛋(44.3 ku)、碳酸苷酶(29.0 ku)、胰蛋白酶抑制劑(20.1 ku)、溶菌酶(14.3 ku)。

1.2.5 酶活力的測定

用20 mmol/L pH 5.0 HAc-NaAc緩沖液溶解人參皂苷Rb1，制成5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為酶反應(yīng)作用的底物。取0.1 mL底物溶液與0.1 mL酶液，于30 ℃下反應(yīng)22 h，加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)，振蕩、離心，取上層液作薄層層析檢測，點(diǎn)樣量為10 μL，展開劑展開，展開劑的配比為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7.0∶3.0∶0.5，噴10%H2SO4水溶液后在105 ℃加熱10 min顯色。應(yīng)用Band-scan工具軟件，進(jìn)行產(chǎn)物含量分析。每小時生成1 μmol人參皂苷F2所需的酶量定義為1個酶活力單位(U/mL)[6-7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種人參皂苷糖苷酶的分離純化及分子質(zhì)量的測定

將Glc8和Glc4粗酶液經(jīng)DEAE-Cellulose DE52離子交換柱層析分離提純，用自動部分收集器收集，將鹽梯度細(xì)化，把相對純的酶回收重新上柱，進(jìn)行反復(fù)純化，最終得到提純蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1所示。

圖1 純化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Polyaerylamide gel SDS electrophoresis of dioscin glycosidase

由圖1可以看出，Glc8 和Glc4兩種人參皂苷糖苷酶在電泳圖上是單帶，通過待測蛋白質(zhì)的遷移率來計(jì)算其分子質(zhì)量，Glc8和Glc4的分子質(zhì)量均為71～72 ku。

2.2 Glc8和Glc4的酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.1 pH 值對酶反應(yīng)的影響

分別取pH 2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖溶液配置的質(zhì)量濃度為5 mg/mL底物溶液 (人參皂苷Rb1) 0.1 mL與0.1 mL酶液均勻混合，在30 ℃下反應(yīng)，然后加入0.2 mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，取上層液作薄層層析檢測，計(jì)算相對酶活力，確定酶反應(yīng)的pH值，其結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Glc8和Glc4在pH值為5.0左右時相對酶活力最高，當(dāng)pH小于5.0或大于5.0時，相對酶活力隨著pH值的變化而下降，說明Glc8和Glc4在中性偏酸的環(huán)境下酶活力較高，在過酸或過堿的環(huán)境下反應(yīng)活性很低。因此，將Glc8和Glc4酶反應(yīng)的最適pH值定為5.0。

圖2 pH 值對Glc8和Glc4相對酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on Glc8 and Glc4 relative activity

2.2.2 溫度對酶反應(yīng)的影響

在底物質(zhì)量濃度為5 mg/mL，pH 5.0的反應(yīng)條件下，取0.1 mL底物溶液(人參皂苷Rb1)與0.1 mL酶液混合，分別于20、30、40、50、60、70、80 ℃下反應(yīng)。然后加入0.2 mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，振蕩、分層，取上層液作薄層層析檢測，計(jì)算相對酶活力，確定酶反應(yīng)的最適溫度，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，Glc8和Glc4在30 ℃時相對酶活力最高，說明Glc8和Glc4在30 ℃時反應(yīng)活性較高，比較耐熱；當(dāng)溫度小于30 ℃或溫度大于30 ℃時，酶反應(yīng)活性都隨著溫度的變化而急劇下降，說明這兩種酶在較低溫度或較高溫度下反應(yīng)活性很低，受溫度影響較大。因此，Glc8和Glc4的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖3 溫度對Glc8和Glc4相對酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on Glc8 and Glc4 relative activity

2.2.3 金屬離子對酶反應(yīng)的影響

以人參皂苷Rb1為酶反應(yīng)底物，選用6種不同的金屬離子(K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+)，以不同濃度加入酶反應(yīng)體系，于30 ℃，pH 5.0 的條件下反應(yīng)22 h，用水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，振蕩、分層，取上層液作薄層層析檢測，計(jì)算相對酶活力，可以測定金屬離子對Glc8(或Glc4)酶反應(yīng)的影響，結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對Glc8和Glc4的酶活力影響Tab.1 Effect of metal ions on enzyme activity

由表1可知，金屬離子K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+對Glc8和Glc4的酶反應(yīng)影響不大；而Cu2+不同程度地對Glc8G和Glc4有明顯的抑制作用。

2.3 Glc8和Glc4的酶反應(yīng)特性

2.3.1 Glc8和Glc4與苷類物質(zhì)為底物的反應(yīng)

將Glc8(或Glc4) 酶液0.1 mL與質(zhì)量濃度為5 mg/mL的不同底物(金絲桃苷、橙皮苷、槲皮苷、異槲皮苷、柚皮苷、淫羊藿苷、蘆丁、柴胡皂苷、虎眼萬年青皂苷、白頭翁皂苷、朱砂根皂苷、穿山龍薯蕷皂苷、黃芪皂苷) 溶液等體積混合，于30 ℃、pH 5.0的條件下反應(yīng)22 h，然后用0.2 mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，振蕩、分層，取上層液作薄層層析檢測，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表2。

由表2可知，兩種酶液均可水解金絲桃苷C-3位末端上的一個α-Gal，也可水解異槲皮苷、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1母環(huán)末端的β-Glc，對其他母環(huán)側(cè)鏈末端帶有α-Rha的苷類物質(zhì)均沒有水解作用。因此，兩種酶具有專一性水解母環(huán)末端的α-Gal、β-Glc鍵的特異性。

2.3.2 Glc8和Glc4與pNP系列底物的反應(yīng)

由表3可知，兩種酶對pNP-β-D-Glc和pNP-α-D-Gal有很好的水解作用，對pNP-β-D-Gal和pNP-α-D-Glc的水解能力極低，對pNP-α-L-Rha完全沒有水解作用。這一結(jié)果，同上面的與苷類物質(zhì)為底物的反應(yīng)結(jié)果相似，兩種酶均可水解pNP母環(huán)末端的α-Gal、β-Glc鍵。

表2 Glc8和Glc4 的酶反應(yīng)特性Tab.2 Research of Glc8 and Glc4 reaction characteristics

表3 Glc8和Glc4與pNP系列底物的反應(yīng)Tab.3 The reaction of Glc8 and Glc4with pNP series

3 結(jié) 論

通過將菌種Absidiasp.G8r產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶和Absidiasp.G4r產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶進(jìn)行分離純化和對它們的酶性質(zhì)和酶學(xué)特性的研究，得出二者的分子質(zhì)量、酶性質(zhì)和酶學(xué)特性相同，最終確定這兩種菌種產(chǎn)的是同一種人參皂苷糖苷酶。二者的分子質(zhì)量均為71～72 ku，最適酶反應(yīng)pH是5.0，最適酶反應(yīng)溫度30 ℃，金屬離子K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+對酶反應(yīng)的影響不大，Cu2+對人參皂苷糖苷酶有很明顯的抑制作用；同時，兩種酶液均可水解金絲桃苷C-3位末端上的一個α-Gal，也可水解異槲皮苷、淫羊藿苷、人參皂苷Rb1母環(huán)末端的β-Glc，對其他母環(huán)側(cè)鏈末端帶有α-Rha的苷類物質(zhì)均沒有水解作用；同時，兩種酶均可水解pNP母環(huán)末端的α-Gal、β-Glc鍵。因此，兩種酶具有專一性水解母環(huán)末端的α-Gal、β-Glc鍵的特異性。

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