任 靜，楊 勇，王 芳，魏光全，葛雅麗，常英娟，楊安鋼，宦 怡*

近年來(lái)前列腺癌(prostatic cancer, PCa)在我國(guó)發(fā)病率逐年上升[1]，分子影像學(xué)(molecular imaging)的發(fā)展為PCa診斷及治療開辟了新的領(lǐng)域[2]。前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是PCa的腫瘤標(biāo)志物之一[3]；納米金磁微粒是一種具有Fe3O4/Au核/殼結(jié)構(gòu)的納米微粒，它既具有超順磁性又具備膠體金的特點(diǎn)，可以通過(guò)簡(jiǎn)便的方法偶聯(lián)微量抗體[4]。本實(shí)驗(yàn)室首次以金磁微粒作為MR對(duì)比劑標(biāo)記抗人PSCA單抗7F5，構(gòu)建了PCa特異性MR分子探針7F5@GoldMag，本文擬重點(diǎn)探討該特異性分子探針在體外MR成像檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：前列腺癌PC-3細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科提供，對(duì)照組人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：實(shí)驗(yàn)組PSCA特異性分子探針7F5@GoldMag及對(duì)照組小鼠抗人非特異性抗體IgG@GoldMag均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶(Sigma公司，USA)，GoldMagTM-CS納米金磁微粒抗體固定化試劑盒(陜西西大北美基因股份有限公司)。

主要設(shè)備：SHEL-LAB CO2孵箱(美國(guó)Shelton機(jī)械制造公司)、磁共振成像系統(tǒng)(Siemens Magnetom trio#tim 3.0T，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃、5%CO2濃度條件孵箱中培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，倒去培養(yǎng)液，0.1% PBS液清洗一遍，加入0.1%胰蛋白酶約3 ml，顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓后加入4 ml新鮮培養(yǎng)液，吹打均勻，吸出移入離心管，800rpm離心5 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液吹打至懸浮，1∶3傳代，標(biāo)記后放恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的可行性：將金磁微粒原液(5mg/mL)100μL以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋(1∶40～1∶1280)混勻后置入1.5 ml離心管，標(biāo)記，放置于4℃環(huán)境下至凝膠凝固；另取PBS分別加入1.5 ml離心管，放入特制試管架，MR成像。掃描參數(shù)： T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 120mm。

7F5@GoldMag體外標(biāo)記前列腺癌細(xì)胞：PC-3和SMMC-7721細(xì)胞分別與7F5@GoldMag、無(wú)關(guān)抗體@GoldMag交叉配對(duì)；將兩種細(xì)胞分別接種于100mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞鋪滿皿底約80%時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次；7F5@GoldMag及無(wú)關(guān)抗體@GoldMag(金磁微粒1 mg/ml，抗體濃度約60μg/ml)各取 2 ml，加入相應(yīng)PC-3和SMMC-7721培養(yǎng)皿內(nèi)；同時(shí)加入50μL羊血清；37℃孵育1 h；PBS漂洗5 min×3次；細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，PBS沖洗后收集細(xì)胞，800rpm離心6 min；按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞團(tuán)塊與1%瓊脂糖凝膠混勻注入1.5 ml離心管，分組標(biāo)記(a: PC-3＋7F5@GoldMag；b: PC-3＋無(wú)關(guān)抗體@GoldMag；c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag；d:SMMC-7721＋無(wú)關(guān)抗體@GoldMag)，4℃放置至凝膠凝固。

MR體外成像：在分別裝有以上四組細(xì)胞凝膠的1.5 ml離心管分別加入PBS，置于充滿PBS的4 ml試管內(nèi)，放入特制試管架，行MR軸位及冠狀位成像，掃描參數(shù)：T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 120mm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所得圖像測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度，每個(gè)感興趣區(qū)包括40(5×8)個(gè)像素，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包，各組間信號(hào)差異比較用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的結(jié)果

圖1 不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微粒T2WI圖像Fig.1 T2WI of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

圖2 不同濃度金磁微粒T2WI信號(hào)強(qiáng)度箱圖比較Fig.2 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微T2WI 序列MR成像結(jié)果見(jiàn)圖1，其信號(hào)差異比較統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖2，GoldMagTM-CS稀釋至1∶640與1%瓊脂糖凝膠相比，T2WI序列信號(hào)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

2.2 7F5@GoldMag作用于前列腺癌細(xì)胞體外MR成像結(jié)果

7F5@GoldMag標(biāo)記PC-3細(xì)胞(管a)T2WI信號(hào)強(qiáng)度明顯降低，標(biāo)記的SMMC-7721細(xì)胞(管c)信號(hào)強(qiáng)度無(wú)降低；而無(wú)關(guān)抗體@GoldMag標(biāo)記的兩種細(xì)胞(管b、d)信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)降低(見(jiàn)圖3)。

圖3 T2WI各試管軸位及冠狀位掃描，各試管依次為a:PC-3＋7F5@GoldMag，b: PC-3＋無(wú)關(guān)抗體@GoldMag，c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag，d: SMMC-7721＋無(wú)關(guān)抗體@GoldMag。管a信號(hào)強(qiáng)度明顯降低Fig.3 T2WI of the tubes (a: PC-3 +7F5@GoldMag,b: PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 + 7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag), T2 signal intensity of tube a showed signi fi cantly decrease.

2.3 各組細(xì)胞MR信號(hào)強(qiáng)度差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

管a、b之間信號(hào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；管b、c、d之間信號(hào)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.618)(見(jiàn)圖4)。

3 討論

3.1 MR分子影像探針構(gòu)建策略

分子影像探針是指對(duì)某一特定生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、RNA)具有特異性、靶向性并能夠進(jìn)行體內(nèi)和/或體外示蹤的標(biāo)記化合物分子，它能夠在體和/或離體反映靶生物分子的量和/或功能。目前，MR分子成像以其高分辨率及成像參數(shù)的多元性而被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是最理想的分子影像學(xué)技術(shù)之一[5]，具有非常好的前景，但其敏感度相對(duì)較差。靶向性MR分子探針由與靶具有高親和力的配體(如抗體、肽或小分子化合物)經(jīng)特定的方法與順磁性對(duì)比劑連接構(gòu)成，利用靶特異性探針與靶目標(biāo)直接結(jié)合而成像[6]。目前亟需研究開發(fā)新型分子探針，使MR不僅具有極高的空間分辨力，還具有較高的敏感性。

圖4 各組細(xì)胞T2WI信號(hào)強(qiáng)度箱圖比較Fig.4 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of the tubes (a: PC-3 + 7F5@GoldMag, b:PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 +7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag).

3.2 納米金磁微粒及其對(duì)MR信號(hào)的影響

納米金磁微粒是具有Fe3O4(核)/Au(殼)結(jié)構(gòu)的復(fù)合超順磁性納米微粒[4]，本實(shí)驗(yàn)首次采用直徑50nm的金磁微粒作為MR信號(hào)組件，其Fe3O4核直徑約20nm，金殼厚度約15 nm，其創(chuàng)新點(diǎn)在于將氧化鐵納米微粒用金殼來(lái)包被，使其既具有超順磁性，又具有膠體金的性質(zhì)[7]，從而通過(guò)表面靜電作用、疏水相互作用、蛋白氨基酸殘基側(cè)鏈的巰基與金的作用等[7-9]將其與單抗偶聯(lián)，可最大限度保留被偶聯(lián)分子的生物活性，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，抗體固定化效率高。與其他MR對(duì)比劑相比，優(yōu)勢(shì)明顯。它本質(zhì)上仍屬于SPIO范疇，對(duì)MR信號(hào)的影響也主要表現(xiàn)為產(chǎn)生較強(qiáng)的T2負(fù)性對(duì)比，因此本實(shí)驗(yàn)的MR掃描序列以T2WI為主。在操作中將金磁微粒以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋后4℃放置至凝膠凝固，主要是為了避免金磁微粒沉淀引起的信號(hào)不均勻現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋至1∶640的金磁微粒T2WI信號(hào)強(qiáng)度仍顯著低于1%瓊脂糖凝膠(P=0.000)。更低濃度的金磁微粒對(duì)MR信號(hào)影響輕微。金磁微粒在臨床應(yīng)用的3.0T場(chǎng)強(qiáng)MR掃描儀條件下具備作為對(duì)比劑的條件，基于這一結(jié)果，可以認(rèn)為以金磁微粒作為對(duì)比劑所構(gòu)建的探針能夠應(yīng)用于MR成像。

3.3 7F5@GoldMag對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外MR信號(hào)的影響

用高親和力分子探針來(lái)辨認(rèn)和證實(shí)相關(guān)受體是分子成像的先決條件。我們用抗人PSCA單抗7F5與納米金磁微粒偶聯(lián)構(gòu)建前列腺癌特異性分子探針7F5@GoldMag，將其與PC-3細(xì)胞孵育，行MR掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可特異性降低PC-3細(xì)胞的T2WI信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞T2WI信號(hào)無(wú)明顯影響。利用類似方法檢測(cè)無(wú)關(guān)抗體@GoldMag對(duì)兩種細(xì)胞T2WI信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)明顯影響。7F5@GoldMag與PSCA陽(yáng)性細(xì)胞PC-3的特異性結(jié)合是其作為前列腺癌特異性分子探針的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以PSCA為靶向分子的MR探針7F5@GoldMag用于體外前列腺癌細(xì)胞MR成像，可特異性降低PC-3細(xì)胞的T2WI信號(hào)，從而為下一步體內(nèi)MR成像實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]顧方六.現(xiàn)代前列腺病學(xué).北京:人民軍醫(yī)出版社,2002.Gu FL.Modern Prostatic Disease.Beijing: People's Military Medical Press, 2002.

[2]Weissleder R, Mahmood U.Molecular imaging.Radiology, 2001,219(2):316-333.

[3]Raff AB, Gray A, Kast WM.Prostate stem cell antigen: A prospective therapeutic and diagnostic target.Cancer Lett,2009, 277(2):126-132.

[4]Daniel MC, Astruc D.Gold nanoparticles: assembly,supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology.Chem Rev, 2004, 104(1): 293-346.

[5]Weissleder R, Moore A, Mahmood U, et al.In vivo magnetic resonance imaging of transgene expression.Nat Med, 2000, 6(3):351-355.

[6]Saji H.Development of radiopharmaceuticals for molecular imaging.International Congress Series, 2004,126(4):139-147.

[7]Selvakannan P, Mandal S, Phadtare S, et al.Capping of gold nanoparticles by the amino acid lysine renders them water-dispersible.Langmuir, 2003, 19 (8): 3545-3549.

[8]崔亞麗,惠文利,汪慧蓉,等.Fe3O4/Au復(fù)合微粒制備條件及性質(zhì)研究.中國(guó)科學(xué)(B輯),2003,33(6): 482-488.Cui YL, Hui WL, Wang HR, et al.Preparation and Properties of Fe3O4/Au hybrid nanoparticles.Science in China (Series B), 2003,33(6): 482-488.

[9]崔亞麗,惠文利,蘇婧,等.Fe3O4/Au納米復(fù)合粒子及其光學(xué)性質(zhì).中國(guó)科學(xué)(B輯),2005,35(2): 89-93.Cui YL, Hui YW, Su Jing, et al.Fe3O4/Au hybrid nanoparticles and its optical properties.Science in China(Series B), 2005,35(2): 89-93.