蔣冬冬,李 莉,趙新海,張慶華,關(guān)艷麗,鐘麗娟,朱巍巍,郭玲玲

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽(yáng) 110161;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧朝陽(yáng) 122000)

產(chǎn)漆酶真菌的篩選及其固態(tài)發(fā)酵條件研究

蔣冬冬1,李 莉2＊,趙新海2,張慶華2,關(guān)艷麗2,鐘麗娟2,朱巍巍2,郭玲玲2

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽(yáng) 110161;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧朝陽(yáng) 122000)

用愈創(chuàng)木酚平板法對(duì)14株白腐真菌進(jìn)行初篩,通過(guò)測(cè)定漆酶活力進(jìn)行復(fù)篩,篩選出1株生活力較強(qiáng),產(chǎn)漆酶活力高的菌株MZ-1,經(jīng)ITS-5.8S r DNA序列分析,初步鑒定為T(mén)rametes versicolor。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對(duì)該菌株產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行正交優(yōu)化,得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮∶秸稈粉∶豆粕∶玉米粉為3∶3∶2∶1,可溶性淀粉2%,(NH4)2SO4+蛋白胨1%,KH2PO40.1%,料水比1∶2。接種4個(gè)菌塞,溫度為30℃,發(fā)酵8 d后酶活可達(dá)到1555.57 U/g。

漆酶;固態(tài)發(fā)酵;發(fā)酵條件;正交優(yōu)化

漆酶(laccase,ECI.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,與抗壞血酸氧化酶和哺乳動(dòng)物血漿銅藍(lán)蛋白同源,都屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族。在自然界中,漆酶分布于多種植物、真菌體內(nèi)以及少數(shù)昆蟲(chóng)和細(xì)菌中[1]。漆酶皆為糖蛋白,其含糖量和種類(lèi)因來(lái)源不同而有所不同,該酶具有廣泛的底物專一性。不同漆酶之間的作用范圍也不盡相同,涉及的底物主要包括單酚、對(duì)-苯二酚、甲氧基酚、抗壞血酸和二胺化合物(如苯二胺、多巴胺)等[2]。由于漆酶具有氧化與木質(zhì)素有關(guān)的酚類(lèi)和非酚類(lèi)化合物以及高度難降解環(huán)境污染物的能力,因此在食品工業(yè)、制漿和造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、土壤的生物修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1,3-4]。目前對(duì)漆酶的生產(chǎn)研究較多的是液態(tài)發(fā)酵,但在自然界中,白腐菌主要生長(zhǎng)在木材上,固態(tài)發(fā)酵比較適合自然界的生態(tài)環(huán)境,且固態(tài)發(fā)酵具有原料來(lái)源廣泛[5],易于推廣等優(yōu)點(diǎn),已成為近幾年研究的熱點(diǎn)之一[6-7]。本研究從自然界篩選能產(chǎn)生漆酶的真菌,優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵條件,以期為今后的研究和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 自分離的白腐菌3株,實(shí)驗(yàn)室保藏白腐菌11株,共14株。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2%,滅菌后添加愈創(chuàng)木酚0.04%;②復(fù)篩培養(yǎng)基:麩皮3 g,秸稈粉2 g,豆粕2 g,玉米粉2 g,水9 mL;③固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:麩皮∶秸稈粉∶豆粕∶玉米粉為3∶3∶2∶1,可溶性淀粉5%,(NH4)2SO4+蛋白胨2%, KH2PO40.2%,料液比1∶2。

1.2 方法

1.2.1 初篩 取活化6 d的菌株平板,用打孔器制備1.0 cm的菌塞,接種到PDA-愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基平板中,置(30±1)℃條件下恒溫培養(yǎng)4 d,記錄菌落周?chē)袩o(wú)紅棕色輪環(huán)產(chǎn)生,菌落生長(zhǎng)的直徑為d1,變色圈直徑為d2,計(jì)算d1∶d2,根據(jù)所產(chǎn)生變色圈的大小及變色程度,選出d1∶d2比值較小且生活力較高的菌株并用保藏培養(yǎng)基留種。

1.2.2 復(fù)篩 將初篩所得的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中,進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn),最終分離得到產(chǎn)漆酶活力較高的絲狀真菌。

1.2.3 菌株鑒定 ①菌株形態(tài)觀察:于PDA固體培養(yǎng)基中平板劃線培養(yǎng)菌株,觀察菌落特征;制作菌絲玻片,于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲特征;②菌株分子鑒定:a.ITS-5.8S rDNA序列擴(kuò)增與測(cè)序: DNA提取參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[8]中基因組制備的方法,以引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性98℃,5 min;變性95℃,35 s;復(fù)性55℃, 35 s;延伸72℃,40 s;35個(gè)循環(huán),最終72℃,充分延伸8 min。經(jīng)切膠純化的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞,檢測(cè)到載體已連接到目的片段之后交由上海生物工程有限公司完成測(cè)序。b.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建:將菌株MZ-1的ITS-5.8S rDNA測(cè)序結(jié)果提交Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST,使用Bioedit將與之同源性較高的序列進(jìn)行Clustal w比對(duì),通過(guò)MEGA軟件采用鄰位相鄰法作出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 粗酶液的制備 對(duì)各種樣品分別取樣3 g,加30 mL蒸餾水,25℃,160 r/min,振蕩浸提4 h,用8層紗布過(guò)濾后,3500 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液,置4℃冰箱待用。

1.2.5 漆酶活力的測(cè)定方法 按參考文獻(xiàn)[9]略作改動(dòng)。3 mL反應(yīng)總體積中,含0.1 mL酶液

2.7mL 0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5),加入0.2 mL 0.5 mmol/L ABTS以啟動(dòng)反應(yīng),于30℃下反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)液在最初3 min內(nèi)420 nm處吸光值的增加。1個(gè)酶活力單位(U)是指在上述條件下,反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol ABTS氧化所需的酶量。測(cè)定值與稀釋倍數(shù)的乘積即為待測(cè)樣品的酶活力。所有測(cè)量均重復(fù)3次,取平均值。

1.2.6 產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件優(yōu)化 在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,保持發(fā)酵底料的配比不變,對(duì)影響漆酶產(chǎn)生的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽以及料水比4因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),其因素水平見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶條件試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor and level table of orthogonal-test of enzyme production

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶高產(chǎn)菌株篩選

2.1.1 初篩 選擇生活力高的菌種也是篩選高效菌種的必要條件之一,生活力的高低用菌種在PDA固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度來(lái)衡量。菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定采用菌落直徑測(cè)定法[10]。表2為各菌株在愈創(chuàng)木酚-PDA平板中生長(zhǎng)、產(chǎn)圈情況, 14株菌中,菌株X25的d1與d2的比值較小,但是其菌絲生長(zhǎng)速度比較慢,生活力較低,LZ菌株生長(zhǎng)速度最快,但是其比值大于1,綜合考慮,本試驗(yàn)選擇P89、MZ-1、DF-1、NC-1、YH2作為下一步進(jìn)行復(fù)篩的試驗(yàn)菌株。

表2 菌株菌落直徑(d1)、變色圈直徑(d2)及其比值(d1/d2)Table 2 Colony diameter(d1)、photochromic laps(d2)and their ratio(dl/d2)

2.1.2 復(fù)篩 對(duì)初篩得到的5株菌采用復(fù)篩培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,菌株NC-1產(chǎn)漆酶活力最高,依次為YH2、MZ-1、P89、DF-1,前三者的酶活差異并不大,又因菌株NC-1,YH2在固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度以及菌絲旺盛程度較MZ-1慢很多,因此選擇MZ-1菌株作下一步研究。

表3 各菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶情況Table 3 Enzyme production conditions of Solid-state fer mentation by different strains

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株形態(tài)觀察 菌株平板劃線,菌絲生長(zhǎng)良好,30℃培養(yǎng)3 d觀察到菌落,菌落形態(tài)如圖1,MZ-1菌落扁平致密,菌絲白色絨狀。1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察,MZ-1菌絲形態(tài)見(jiàn)圖2,其菌絲有橫隔,較多分枝,有明顯的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。

圖1 M Z-1菌落形態(tài)Fig.1 Colonymorphology ofMZ-1

圖2 顯微鏡下M Z-1菌絲形態(tài)(1000×)Fig.2 Hyphalmorphology of MZ-1 undermicroscope(1000×)

2.2.2 菌株MZ-1的ITS-5.8S rDNA序列分析菌株MZ-1的ITS-5.8S rDNA序列測(cè)定片段長(zhǎng)度為622bp,序列提交GenBank,登錄號(hào)為HQ172001。將菌株MZ-1的ITS-5.8S r DNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST,結(jié)果顯示該菌株ITS-5.8S r DNA序列與栓菌屬同源性最高,相似性大于99%,利用MEGA4.1的Neighor-joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,結(jié)果見(jiàn)圖3。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出菌株MZ-1與AY840587.1聚在同一分支,其置信度為70%,遺傳距離顯示菌株MZ-1與AY840587.1的遺傳距離最近,達(dá)到99.7%。遺傳距離顯示菌株MZ-1與栓菌屬的遺傳距離相近。結(jié)合形態(tài)觀察,參照《真菌鑒定手冊(cè)》,初步確定菌株MZ-1屬于栓菌屬變色栓菌組中的變色栓菌(Tram etes versicolor)。

圖3 以ITS-5.8S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the homology of ITS-5.8S rDNA sequences

2.3 產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化

表4 產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Factor analysis is table of orthogonal-test of enzyme production

極差分析(表4)可見(jiàn):各因素對(duì)產(chǎn)酶影響的次序依次為C＞B＞D＞A,最佳組合是A2B2C1D2,優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方:可溶性淀粉2%,(NH4)2SO4+蛋白胨1%,KH2PO40.1%,料水比1∶2。該菌株在麩皮∶秸稈粉∶豆粕∶玉米粉為3∶3∶2∶1,可溶性淀粉3%,(NH4)2SO4+蛋白胨1%,KH2PO40.1%,料水比1∶2,接種4個(gè)菌塞/250 mL三角瓶,8 d,30℃條件下,漆酶的活性為1555.57 U/g。

3 討 論

利用分子生物學(xué)方法對(duì)未知菌種進(jìn)行鑒定早已得到了廣大學(xué)者的充分肯定和日益廣泛的應(yīng)用,分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)生理生化法相比更加節(jié)省人力物力,而且鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[11]。本文篩選得到1株產(chǎn)漆酶活力較高的菌株MZ-1,經(jīng)ITS-5.8S rDNA序列分析,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,初步鑒定為T(mén)ram etes versicolor。

固態(tài)發(fā)酵周期雖較長(zhǎng),但較液態(tài)發(fā)酵操作簡(jiǎn)便、能耗低、產(chǎn)物濃度高、回收費(fèi)用較低。本文利用麩皮、秸稈、豆粕等廢料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,原料成本低,有利于環(huán)境保護(hù)。采用正交分析,對(duì)MZ-1產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了初步研究,得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮∶秸稈粉∶豆粕∶玉米粉為3∶3∶2∶1,可溶性淀粉2%,(NH4)2SO4+蛋白胨1%, KH2PO40.1%,料水比1∶2。在溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間8 d后酶活達(dá)到1555.57 U/g,是優(yōu)化前的3倍左右。施曉燕等[12]分離的白腐真菌其產(chǎn)酶活力為13.233 U/g。相比而言MZ-1在產(chǎn)酶方面有較高的優(yōu)越性,在以后的試驗(yàn)中將進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)MZ-1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化,技術(shù)改良使其更加高產(chǎn),并對(duì)該菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)酶曲線以及所產(chǎn)漆酶的性質(zhì)進(jìn)行研究。

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Screening of Laccase-Producing Fungal Stra in and the Preliminary Study on the Solid-State Fermentation Conditions

JIANG Dong-dong1,LI Li2,ZHAO Xin-hai2,ZHANG Qing-hua2, GUAN Yan-li2,ZHONG Li-juan2,ZHU Wei-wei2,GUO Ling-ling2
(1.Shenyang Agric.Uni.,Shenyang110161;2.Liaoning Sci.Res.Acad.of Microbiol.,Chaoyang 122000)

Fourteen white-rot fungal strains were first screened by guaiacol plate method,and then rescreened by testing the laccase activity,finally obtained one white-rot fungus MZ-1 with strong vitality and high laccase activity;and it was identified initially as Trametes versicolor by ITS-5.8S rDNA sequences analysis.Based on the solid-state medium,cultural medium components for laccase production were optimized by means of orthogonal experiments,they were:wheat bran∶straw powder∶bean cake powder∶cornmeal at 3∶3∶2∶1,added 2%soluble starch,1% (NH4)2SO4plus peptone,and 0.1%KH2PO4,and the proportion of water and medium was 1∶2.Inoculated with four fungal plugs,and fermented for 8d at 30℃,the laccase activity could reach as high as 1555.57 U/g.

laccase;solid-state fermentation;fermentation conditions;orthogonal optimization

Q93

A

1005-7021(2010)06-0055-05

遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009301005)

蔣冬冬 男,碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源。E-mail:jdong2010@126.com

＊通訊作者。Tel:0421-2913910,E-mail:liligom@163.com

2010-10-12;

2010-11-14