柯崇榕,黃 薇,秦 勇,田寶玉,黃建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心,福建福州 350108)

側(cè)孢短芽胞桿菌產(chǎn)生線蟲侵染性蛋白酶的優(yōu)化

柯崇榕,黃 薇,秦 勇,田寶玉,黃建忠＊

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心,福建福州 350108)

采用單因素試驗(yàn)確定側(cè)孢短芽胞桿菌G4產(chǎn)線蟲侵染性蛋白酶的最佳碳氮源,通過Placket-Bur man設(shè)計(jì)篩選影響蛋白酶活力的主效因子,最陡坡試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)獲得主效因子的最佳水平,建立線蟲侵染性蛋白酶的最佳生產(chǎn)體系:葡萄糖9.78 g/L、牛肉膏16.65 g/L、磷酸氫二鉀0.75 g/L、可溶性淀粉12.5 g/ L、氯化鈉0.75 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、初始pH值自然、裝液量50 mL,37℃搖瓶培養(yǎng)32 h,蛋白酶活力可達(dá)12379.41 U/mL,較優(yōu)化前的2476.3 U/mL提高了4倍。

侵染線蟲;蛋白酶;側(cè)孢短芽胞桿菌;響應(yīng)面;優(yōu)化

植物寄生線蟲是農(nóng)業(yè)重要病害之一,全世界每年由于植物寄生線蟲病害所引起的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到1000億美元,嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的良好發(fā)展[1]。由于對環(huán)境的破壞以及對人畜安全性的影響,目前使用的化學(xué)防治正逐步受到限制。具有環(huán)境友好性和無耐藥性的線蟲生物防治日顯迫切和重要[2]。目前,以生長快速、易于培養(yǎng)的食線蟲細(xì)菌為基礎(chǔ)的天然活菌劑正逐步成為新的研究熱點(diǎn)[3]。側(cè)孢短芽胞桿菌(B.laterosporus)G4具有很強(qiáng)的殺線蟲活性,可以有效地殺死松材線蟲和腐生線蟲[4]。B.laterosporusG4殺線蟲活性是由其胞外蛋白酶的高活力引起的。顯微觀察、電鏡觀察并結(jié)合化學(xué)免疫熒光觀察表明B.laterosporusG4分泌的蛋白酶通過對線蟲體壁的降解和破壞來殺死線蟲,并且線蟲侵染活性與蛋白酶活力成正相關(guān)[5-6]。本研究通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),對影響B(tài).laterosporusG4分泌蛋白酶的因素進(jìn)行優(yōu)化使其提高分泌蛋白酶的活力,為提高B.laterosporusG4的線蟲侵染能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 側(cè)孢短芽胞桿菌Bacillus laterosporusG4產(chǎn)線蟲侵染性蛋白酶,由云南大學(xué)張克勤教授惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 5;②發(fā)酵初始培養(yǎng)基:葡萄糖10,酵母膏10,NaCl 0.4,K2HPO40.03, MgSO40.02。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力測定 蛋白酶活力采用國標(biāo)SB/T10317-1999測定,酶活定義:在50℃,pH 10.0的條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,所需的酶量為一個酶活力單位(I U)。

1.2.2 單因素輪換設(shè)計(jì) 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),采用單因素試驗(yàn)初篩最適的碳氮源。分別以蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、硫酸銨、酵母浸出物、胰蛋白胨為氮源,在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)32 h,分析最佳氮源;在最佳氮源基礎(chǔ)上分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精為碳源,篩選最佳碳源。

1.2.3 Plackett-Burrman(PB)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)所確定的最佳碳氮源為碳氮源的初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選用9個因素、試驗(yàn)次數(shù)為12、重復(fù)次數(shù)為2次的Plackett-Burrman試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察影響蛋白酶活力的主效應(yīng)因素及其各因素之間的一級交互作用,篩選G4產(chǎn)線蟲侵染性蛋白酶的重要因素。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)PB設(shè)計(jì)篩選出3個主要影響因素效應(yīng)值的正負(fù)及其大小設(shè)計(jì)各主要影響因素的爬坡方向和步長,進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),以逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域,建立有效的擬合方程。以最佳的爬坡試驗(yàn)條件組為水平中心點(diǎn),根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行3因素3水平15個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 9.2和DPS 7.05對試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲侵染性蛋白酶活力分析

利用Folin-酚法測定蛋白酶活力,繪制B.laterosporusG4線蟲侵染性蛋白酶活力曲線,見圖1。結(jié)果表明,G4培養(yǎng)32 h,菌體處于穩(wěn)定期,蛋白酶活力最高可達(dá)2476.3 U/mL。

圖1 側(cè)孢短芽胞桿菌G4的侵染性蛋白酶活力曲線Fig.1 Protease activity curve of B.laterosporusG4

2.2 最適碳氮源的篩選

以發(fā)酵初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察不同碳氮源(10 g/L)對G4產(chǎn)線蟲侵染性蛋白酶的影響,見圖2和圖3。從圖2、圖3中可以看出,G4在以牛肉膏為氮源,可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基體系中蛋白酶活力最高,可達(dá)8963.46 U/mL。

圖2 不同氮源對蛋白酶活力的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on producing protease

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果,選擇葡萄糖、牛肉膏、可溶性淀粉、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4和CaCl2作為優(yōu)化輸入因子,蛋白酶活力為響應(yīng)值,進(jìn)行Plackett-Burr man(N=12)設(shè)計(jì),見表1。

圖3 不同碳源對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effects of carbon sources on producing protease

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)值Table 1 Experimental response of Plackett-Burman

通過SAS 9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和因素主效應(yīng)分析,見表2。從表2可以看出,牛肉膏X2對蛋白酶活力的影響最大(P＜0.01,極顯著),其次為葡萄糖X1(P＜0.05)、磷酸氫二鉀X6(P＜0.05)和硫酸鎂X7(P＜0.05),其他因素對蛋白酶活力影響不顯著。牛肉膏X2、硫酸鎂X7和硫酸銨X8表現(xiàn)為正作用,其他變量表現(xiàn)為負(fù)作用。一階優(yōu)化試驗(yàn)?zāi)Ｐ虵檢驗(yàn)為0.035972＜0.05,可信度超過95%。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表Table 2 Analysis of variance for Plackett-Bur man design

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)一階優(yōu)化結(jié)果,以牛肉膏、葡萄糖和K2HPO43個因素為主效因子進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)二階優(yōu)化。

2.4.1 最陡坡試驗(yàn) 最陡坡試驗(yàn)因子為PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)中表現(xiàn)為顯著性的因子(P＜0.05)。因子變化的方向和步長由一次多元線性編碼方程中的變量系數(shù)確定,其正負(fù)確定變量的增減方向,其大小決定步長的長短,見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 3 Results and experimental design of Stee Pest Ascent Search

2.4.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn),選取第2組試驗(yàn)點(diǎn)作為中心點(diǎn)進(jìn)行BOX-Behnken二階優(yōu)化,借助SAS 9.2軟件輔助進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與擬合分析見表4,根據(jù)BOXBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型推出二次多元相互作用的擬合回歸方程:Y1=17667.9+3.713292X1+從表4可以看出,回歸方程具有較好的擬合度。

表4 BOX-Behnken設(shè)計(jì)矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實(shí)測值與擬合值Table 4 Test scheme and its observation and simulation values in BOX-Behnken design

2.4.3 二次響應(yīng)面回歸模型的建立 二次響應(yīng)面回歸(RSREG)分析,見表5。

表5 BOX-Behnken設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance in predictive model for BOX-Behnken design

分析表明,牛肉膏和K2HPO4及其相互作用對蛋白酶活力的影響最大,均呈顯著水平(P＜0.05)?？偰Ｐ突貧w顯著性檢驗(yàn)P值=0.0014546,擬合不足顯著性檢驗(yàn)P值=0.0053296,說明模型回歸極顯著,失擬極不顯著,擬合方程式可靠;方差分析顯示方程的線性回歸和二次回歸極顯著(P＜0.01),交叉項(xiàng)回歸顯著(P＜0.05)。因此,該模型可以用于B.laterosporusG4產(chǎn)枯草桿菌蛋白酶發(fā)酵優(yōu)化的理論預(yù)測。

預(yù)測模型的典型相關(guān)分析和嵴嶺分析表明,模型的響應(yīng)面為馬鞍面(存在2個以上的最大值),使用嵴嶺分析在優(yōu)化區(qū)附近尋優(yōu)分析。嵴嶺分析預(yù)測模型響應(yīng)面的最大值為11563.09 U/ mL,相應(yīng)的優(yōu)化因子水平葡萄糖、牛肉膏和K2HPO4分別為9.7817、16.6503、0.7471 g/L。

2.5 最優(yōu)發(fā)酵配方組合的驗(yàn)證

對預(yù)測的響應(yīng)面的最大值在同等條件下進(jìn)行驗(yàn)證,3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)的平均酶活為11563.09 U/mL?；貧w分析見表6。

表6 t測驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測值與觀測值的差異Table 6 Difference between predicted value and observational value byttest

表6表明,在95%置信范圍內(nèi),觀測值的平均值與預(yù)測值相近,差異不顯著(P=0.0473),可見該響應(yīng)面模型較好地預(yù)測了試驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化B.laterosporus G4的液體發(fā)酵生產(chǎn)線蟲侵染性蛋白酶是可行有效的。優(yōu)化從最初酶活力為2476.3 U/mL提高至12379.41 U/mL,提高了4倍。

3 討 論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)獲得可溶性淀粉和牛肉膏為最佳碳氮源;采用Plackett-Burman試驗(yàn)確定牛肉膏、葡萄糖、K2HPO4為3個主效影響因子;在此基礎(chǔ)上通過最陡坡試驗(yàn),確定最佳響應(yīng)區(qū)域;采用中心組合設(shè)計(jì)和SAS 9.2軟件分析,獲得最佳發(fā)酵體系:初始pH值自然、裝液量50 mL、葡萄糖9.7817 g/L、牛肉膏16.6503 g/L、K2HPO40.7471 g/L、可溶性淀粉12.5 g/L、氯化鈉0.75 g/L和硫酸鎂0.5 g/L。在此試驗(yàn)條件下,B.laterosporus G4產(chǎn)生的線蟲侵染性蛋白酶活力可達(dá)12376 U/mL,比優(yōu)化前提高了400%。

[1]Barker K R.Introduction and synopsis of advancements in nematology[M].Madison,W is.(USA):American Society of Agronomy,1998:1-25.

[2]Dong L,Zhang K.Microbial control of plant-parasitic nematodes:a five-party interaction[J].Plant and Soil,2006,288 (1):31-45.

[3]Tian B,YangJ,Zhang KQ.Bacteria used in the biological control of plant-parasitic nematodes:populations,mechanis ms of action,and future prospects[J].FEMS microbiology ecology, 2007,61(2):197-213.

[4]Tian B,Yang J,Lian L,et al.Role of an extracellular neutral protease in infection against nematodes by Brevibacillus laterosporus strain G4[J].Applied microbiology and biotechnology, 2007,74(2):372-380.

[5]Tian B,Ke C,Huang W,et al.Direct visualization of bacterial infection process in nematode hosts by an improved immunocytochemical method[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(6):1175-1179.

[6]Huang X,Tian B,Niu Q,et al.An extracellular protease from Brevibacillus laterosporus G4 without parasporal crystals can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes[J].Research in microbiology,2005,156(5-6):719-727.

Optimization of Nematode Infection-Oriented Protease Production by Bacillus laterosporus

KE Chong-rong,HUANG Wei,QIN Yong,TIAN Bao-yu,HUANG Jian-zhong
(Engin.Res.Ctr.of Indust.Microbiol.,Ministry of Educ.,Coll.of Life Sci., Engin.Res.Ctr.of Fujian Modern Ferment.Technol.,Fujian Normal Uni.,Fuzhou350108)

Single-factor experiments were used to screen the optimum carbon and nitrogen sources for Bacillus laterosporus G4 to produce nematode infection-oriented protease(N I OP).The main effective factors on protease production were screened by Plackett-Burrman design.Then,the path of the steepest ascent and Box-Behnken design was utilized to obtain the optimal level of the main effective factors and established N I OP production system.They were:glucose 9.78 g/L,beef extract 16.65 g/L,K2HPO40.75 g/L,soluble starch 12.5 g/L,NaCl 0.75 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L at natural initial pH with 50 ml of filling volume and cultured in 32℃,250 r/min for32 h.The protease activity of Bacillus laterosporusG4 was as high as 12379.41 U/mL increased by 4 times as compared with 2476.3 U/ mL of the one before the optimization.

infection of nematode;protease;Bacillus laterosporus;RS M;optimization

TQ92

A

1005-7021(2010)06-0006-05

國家自然科學(xué)基金(30800735);福建省杰出青年科學(xué)基金(2009J06014)

柯崇榕 男,助理實(shí)驗(yàn)師。主要從事工業(yè)酶制劑的研究開發(fā)。E-mail:kechr@fjnu.edu.cn

＊通訊作者。Tel:0591-22868212,E-mail:hjz@fjnu.edu.cn

2010-11-10;

2010-11-20