李冬利,陳玉嬋,李義勇,2,陶美華,章衛(wèi)民＊

(1.廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510070; 2.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌 443002)

1株白木香內(nèi)生真菌中抗腫瘤活性成分的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

李冬利1,陳玉嬋1,李義勇1,2,陶美華1,章衛(wèi)民1＊

(1.廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510070; 2.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌 443002)

采用活性追蹤的方法對(duì)白木香內(nèi)生真菌螺旋木霉Trichoderma spiraleA17的抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。通過凝膠柱層析和反相硅膠柱層析,從其發(fā)酵液的活性組分中分離到2個(gè)無色針晶化合物,質(zhì)譜和核磁共振的鑒定結(jié)果表明化合物1是一個(gè)八氫萘衍生物,命名為木霉酸(Trichodermic acid),化合物2是酪醇(Tyrosol)?；钚詫?shí)驗(yàn)顯示化合物1對(duì)SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細(xì)胞株都具有顯著的增殖抑制活性,而化合物2對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞株只有微弱的增殖抑制活性。

白木香;內(nèi)生真菌;螺旋木霉;抗腫瘤;活性追蹤

植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有些與宿主的某些代謝產(chǎn)物相同或相似,有些是其他具有潛在藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物,并且容易從中發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)的化合物,已成為發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源。近年來在植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的活性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型主要有萜類、生物堿類、醌類、黃酮類、異香豆素類、內(nèi)酯類、木脂素類、酚類、多肽類、甾體化合物等[1],報(bào)道的生物活性有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗瘧、抗病毒、殺蟲、酶抑制劑、調(diào)節(jié)植物生長等[2],在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域都展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。利用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)活性物質(zhì)的一個(gè)顯著優(yōu)勢在于資源的可持續(xù)利用,對(duì)自然資源破壞極少,能夠解決自然資源不足的問題,這一點(diǎn)對(duì)于某些珍貴瀕危的藥用植物來說顯得更加重要。白木香(Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg.)別名土沉香、女兒香、莞香,為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物,是一種熱帶及亞熱帶常綠喬木,為我國華南地區(qū)特有的珍貴藥用植物,也是我國生產(chǎn)中藥沉香的唯一的資源植物。《廣東珍稀瀕危植物》報(bào)告[3],廣東省的野生大型白木香由于砍伐過度,已經(jīng)十分稀有,瀕臨絕種。因此,對(duì)白木香內(nèi)生真菌及其活性代謝產(chǎn)物的研究,具有重要的生態(tài)學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。王磊等[4]從采自廣東省不同組織年齡的白木香根、莖、葉以及天然結(jié)香部位分離獲得了50株內(nèi)生真菌,對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抗腫瘤抗菌活性篩選,得到了幾株具有較好生物活性的目標(biāo)菌株[5]。螺旋木霉Trichoder m a spiraleA17是其中1株具有較好抗腫瘤和抗菌活性的菌株。本研究采用活性追蹤的方法對(duì)其抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,為尋找抗腫瘤藥物或藥物先導(dǎo)化合物提供物質(zhì)基礎(chǔ),為開發(fā)利用白木香內(nèi)生真菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 白木香內(nèi)生真菌A17為本實(shí)驗(yàn)室從廣東省信宜市南屯野生白木香(約30 a樹齡)的根部分離得到[4],保存于廣東省微生物研究所。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定,該菌株為螺旋木霉(Trichoderma spirale)。

1.1.2 細(xì)胞株來源 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH460,均由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蔣繼宏教授提供。

1.1.3 儀器和試劑 ①主要儀器:核磁共振波譜儀500MHz,Bruker公司;質(zhì)譜儀API 2000 LC/ MS/MS,MDS SCIEX公司;PZ1000B旋轉(zhuǎn)式大容量普通搖床,武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D (Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵,鞏義市英峪予華儀器廠;DLSB-5/10低溫冷卻液循環(huán)泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Hangping FA2004電子分析天平,上海天平儀器廠;超凈工作臺(tái),上海恒益科技有限公司;②主要試劑:柱層析硅膠(100～200目,200～300目)、GF254高效薄層硅膠板,青島海洋化工廠; C18反相硅膠(40～75μm),Fuji Silysia Chemical Ltd.;凝膠Sephadex LH-20(18～110μm),Amersham Biosciences;石油醚(分析純),天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;乙酸乙酯(分析純),天津富宇精細(xì)化工有限公司;三氯甲烷(分析純),廣州化學(xué)試劑廠;甲醇(分析純)天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乙酸乙酯粗提物的制備 從保藏菌株的試管斜面挑取少許菌絲分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上活化3 d,然后將活化的菌絲接種于裝有250 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中,28℃,120 r/min培養(yǎng)3 d,作為種子液。大量發(fā)酵同樣采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基,每只500 mL搖瓶裝250 mL的培養(yǎng)基,共培養(yǎng)120瓶。28℃,120 r/min培養(yǎng)7 d,發(fā)酵結(jié)束后過濾得發(fā)酵液,用乙酸乙酯萃取4次,合并乙酸乙酯相于40℃下減壓濃縮至膏狀,得乙酸乙酯相粗提物(約1.9 g)。

1.2.2 粗提物的初步分離 乙酸乙酯相粗提物通過正相硅膠柱進(jìn)行初步分離。干法上樣,以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,分段收集。用薄層層析(TLC)檢測(顯色劑為茴香醛-濃硫酸試劑),合并相似組分,濃縮干燥得12個(gè)粗組分(F1～F12)。

1.2.3 粗組分的抗腫瘤活性測定 供試腫瘤細(xì)胞株為SF-268,參考李浩華等[6]采用MTT法測定各粗組分的抗腫瘤活性以確定活性組分。

1.2.4 活性組分中化合物的分離純化 采用凝膠柱層析和反相硅膠柱層析對(duì)活性組分進(jìn)行化學(xué)成分的分離純化。

1.2.5 純化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 通過核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)對(duì)所得純化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1.2.6 純化合物的抗腫瘤活性測定 供試腫瘤細(xì)胞株為SF-268、MCF-7和NCI-H460,采用MTT法測定所得純化合物的抗腫瘤活性。

2 結(jié) 果

2.1 粗組分的抗腫瘤活性

在100μg/mL的作用濃度時(shí),各粗組分對(duì)SF-268細(xì)胞增殖的抑制率見表1。組分F2表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性,TLC檢測顯示其含有2個(gè)主要化學(xué)成分。因此選擇F2組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

表1 粗組分對(duì)SF-268細(xì)胞增殖的抑制率(ˉχ±S,n=3)Table 1 Inhibitory rates of rough fractions on SF-268(ˉχ±S,n=3)

2.2 活性物質(zhì)的分離純化

活性組分F2(90.4 mg)先通過凝膠柱層析(Sephadex LH-20,甲醇洗脫)分為F2-1(46.2 mg)和F2-2(10.3 mg)。F2-1和F2-2再分別通過C18反相硅膠柱層析(ODS-A,甲醇洗脫)得到純化合物1(無色針晶,22.6 mg)和純化合物2(無色針晶,9.0 mg)。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1進(jìn)行電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析,結(jié)果顯示:陰離子模式出現(xiàn)m/z:303[M-H]-、607[2M-H]-2個(gè)峰,陽離子模式出現(xiàn)m/z:305[M+H]+、327[M+ Na]+、609[2M+H]+、631[2M+Na]+幾個(gè)主要峰,因此初步推斷化合物的分子量為304?；衔?的1H-NMR圖譜上(表2)低場區(qū)顯示有5個(gè)不飽和氫信號(hào),根據(jù)偶合常數(shù)(J)可以判斷其中有3個(gè)為互相連接的反式雙鍵氫(J=14.9、11.2 Hz),另2個(gè)為一對(duì)順式雙鍵氫(J=9.5 Hz)。高場區(qū)顯示4個(gè)甲基信號(hào),其中1個(gè)單峰表示與不飽和季碳相連,另外3個(gè)均為雙重峰,均與飽和次甲基相連。高場區(qū)還有一些飽和氫信號(hào)。13CNMR(表2)和無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)(DEPT)圖譜上可以看到19個(gè)碳信號(hào),包括2個(gè)季碳,12個(gè)次甲基,1個(gè)亞甲基和4個(gè)甲基。綜合質(zhì)譜、核磁數(shù)據(jù)確定該化合物分子式為C19H28O3。通過同核化學(xué)位移相關(guān)譜、異核單量子相干譜和異核遠(yuǎn)程化學(xué)位移相關(guān)譜(1H-1H COSY、HSQC和HMBC)等二維核磁共振(2D-NMR)數(shù)據(jù),鑒定1的結(jié)構(gòu)如圖1所示,該化合物屬于八氫萘衍生物。其相對(duì)構(gòu)型通過核Overhauser效應(yīng)譜(NOESY)確定,H-1、H-3、H-5、H-8、H-9等有相關(guān)峰,顯示它們處于分子的同一側(cè),H-2、H-4a、H-10有相關(guān)峰,顯示它們同處于分子的另一側(cè)。由文獻(xiàn)[7]可知,該化合物為已知化合物,化學(xué)名為(2E,4E)-5-((1S, 2S,4aR,6R,7S,8S,8aS)-7-hydroxy-2,6,8-trimethyl-1,2,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl)-2-methylpenta-2,4-dienoic acid。此前,只有Yamada報(bào)道從1株未定種的木霉屬真菌中分離得到過該化合物,本研究的核磁數(shù)據(jù)與其一致,本文將該化合物命名為木霉酸(Trichodermic acid)。

表2 化合物1的氫譜碳譜核磁數(shù)據(jù)(溶劑為氘代甲醇,單位為×10-6)Table 2 1H-and13C-NMR spectral data of compound 1(CD3OD,×10-6)

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式和主要的1H-1H COSY(粗線)、HMBC(箭頭)相關(guān)關(guān)系Fig.1 Structure and key1H-1H COSY(bold line) and HMBC(arrow)correlations of compound 1

2.3.2 化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物2的1HNMR譜上低場區(qū)顯示2個(gè)雙峰(δH:7.05和6.74),每個(gè)峰代表2個(gè)氫,從它們之間的偶合常數(shù)8.1 Hz可以判斷是位于苯環(huán)鄰位的兩組氫,由此可以判斷一個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)的存在。另外高場區(qū)顯示有2個(gè)三重峰信號(hào)(δH:3.69和2.71),每個(gè)峰代表2個(gè)氫,偶合常數(shù)都為7.1 Hz,可見為2個(gè)互相連接的亞甲基,并且其中一個(gè)亞甲基與含氧基團(tuán)相連,另一個(gè)亞甲基與不飽和基團(tuán)相連。13C-NMR和DEPT圖譜上可以看到6個(gè)碳信號(hào), δC:116.0～156.6之間的4個(gè)信號(hào)應(yīng)該是一個(gè)苯環(huán),包括2個(gè)季碳信號(hào),其中δC:156.6處的季碳連接含氧基團(tuán),另包括2個(gè)次甲基信號(hào),分別代表苯環(huán)上未被取代的2個(gè)次甲基;此外,13C-NMR圖譜上另2個(gè)為亞甲基信號(hào)(δC:64.3和39.5),其中δC:64.3處亞甲基應(yīng)與含氧基團(tuán)相連。因此,結(jié)合核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù),確定該化合物為酪醇(Tyrosol),譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致。

圖2 化合物2的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of compound 2

2.4 純化合物的抗腫瘤活性

在20μg/mL的作用濃度時(shí),2個(gè)純化合物對(duì)SF-268、MCF-7和NCI-H460腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性表現(xiàn)出明顯差異(表3)。化合物1對(duì)3種細(xì)胞株都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性,抑制率均在50%以上;而化合物2對(duì)3種細(xì)胞株的抑制作用都較弱。

表3 化合物1和2對(duì)3種細(xì)胞株增殖的抑制率(%) ±S,n=3)Table 3 Inhibitory rates of compounds 1and 2 on three tumor cells(%)±S,n=3)

表3 化合物1和2對(duì)3種細(xì)胞株增殖的抑制率(%) ±S,n=3)Table 3 Inhibitory rates of compounds 1and 2 on three tumor cells(%)±S,n=3)

注:陽性對(duì)照為順鉑水溶液,作用濃度為10μg/mL

細(xì)胞株SF-268MCF-7NCI-H460化合物172.4±0.553.4±1.059.8±3.7化合物21.9±1.29.4±1.36.8±1.4陽性對(duì)照93.0±2.097.6±0.898.4±1.0

3 討 論

本研究通過活性追蹤的方法從白木香內(nèi)生真菌螺旋木霉A17發(fā)酵液的乙酸乙酯相粗提物中得到了具有抗腫瘤活性的八氫萘衍生物—木霉酸。該化合物盡管為已知化合物,但迄今只有Yamada[7]曾經(jīng)分離得到。本研究首次從螺旋木霉中得到該化合物,并首次發(fā)現(xiàn)其對(duì)SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制活性。

細(xì)胞黏附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)是由細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的一類膜表面糖蛋白分子。它參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)與活化,細(xì)胞的伸展和移動(dòng),細(xì)胞的生長及分化,炎癥、血栓形成,腫瘤轉(zhuǎn)移及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理和病理過程。細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于CAMs中的免疫球蛋白超家族成員之一,是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白。已證實(shí)ICAM-1與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、淋巴細(xì)胞歸巢和再循環(huán)、腫瘤以及動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)。Yamada[7]發(fā)現(xiàn),木霉酸及其通過化學(xué)反應(yīng)生成的衍生物能夠抑制I CAM-1的表達(dá),其中有一個(gè)衍生物具有很好的治療炎癥性疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用,并且對(duì)A549、PC-3、As-PC-1和HT1080等腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于對(duì)Hepatocyte、NHDF和BAE等正常細(xì)胞的活性。因此以木霉酸及其衍生物作為I CAM-1表達(dá)抑制劑、炎癥性疾病治療劑、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療劑、免疫抑制劑和細(xì)胞增殖抑制劑申請了專利。本研究發(fā)現(xiàn)木霉酸對(duì)SF-268、MCF-7和NCI-H4603種腫瘤細(xì)胞株也具有顯著的增殖抑制活性,說明它可能具有較廣譜的抗腫瘤活性,其抗腫瘤活性是否可能與其對(duì)I CAM-1的表達(dá)抑制活性相關(guān)值得進(jìn)一步探討。另一方面,本研究從內(nèi)生真菌螺旋木霉中發(fā)現(xiàn)了木霉酸,為木霉酸的來源提供了一種新資源,為利用木霉酸生產(chǎn)藥用衍生物提供了新的資源基礎(chǔ)。

從SciFinder Scholar數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),與木霉酸結(jié)構(gòu)最類似的化合物為coprophilin,區(qū)別只在于側(cè)鏈上甲基位置的不同。coprophilin具有抗雞球蟲(Eim eria tenella)的作用[9],而雞球蟲病是一種寄生蟲病,在世界上普遍發(fā)生,是造成集約化養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失的主要因素之一[10]。因此可以利用螺旋木霉生產(chǎn)木霉酸,然后通過化學(xué)反應(yīng)獲得一系列衍生物,并測試木霉酸及其衍生物的抗球蟲活性,也許可以從中發(fā)現(xiàn)有效的抗球蟲藥物,從而產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益。

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Isolation and Identification of Anti-Tumor Constituents from an Endophytic Fungus of Baimuxiang(Aquilaria sinensis)

LI Dong-li1,CHEN Yu-chan1,LI Yi-yong1,2,TAO Mei-hua1,ZHANG Wei-min1
(1.Guangdong Prov.Open Lab.of Appl.Microbiol.,Guangdong Prov.Key Lab.of Microb.Cult.Collect.and Appl.,Guangdong Inst.of Microbiol.,Guangzhou510070; 2.Hubei Key Lab.of Nat.Prod.Res.&Devel.,Coll.of Chem.and Life Sci.,China Three Gorges Uni.,Yichang443002)

Adopting activity trailing method,anti-tumor active metabolites from the endophytic fungus Trichoderma spiraleA17 in officinal baimuxiang(Aquilaria sinensis)were isolated and identified.Column chromatography on Sephadex LH-20 and C18 silica gel was used,and two kinds of colorless needle crystallized compound were obtained from the active constituent of fer mentation broth.Data analysis of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, indicated the compound 1 was an octo-hydrogen derivative of naphthalene and named as trichodermic acid,and compound 2 was tyrosol.Compound 1 showed significant inhibitory activities against tumor cells SF-268,MCF-7,and NCI-H460,while compound 2 displayed onlyweak hyperplasia inhibition activities against these tumor cells.

Aquilaria sinensis;endophytic fungi;Trichoderma spirale;antitumor;activity trailing

R73-3;R284

A

1005-7021(2010)06-0001-05

國家自然科學(xué)基金(20902014);廣東省自然科學(xué)基金(9451007002003074);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(09B34061446);廣東省科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才基金

李冬利 女,助理研究員,博士。研究方向?yàn)槲⑸锘钚源x產(chǎn)物。

Tel:020-87688612,E-mail:yichen802003@yahoo.com.cn

＊通訊作者。Tel:020-37656321,E-mail:wmzhang58@yahoo.com.cn

2010-09-19;

2010-11-22