羅 玲,艾地云,楊 峻,王紅琳,溫國元,羅青平,張蓉蓉,邵華斌

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北武漢 430064)

沙門菌病是由沙門菌屬引起的消化道傳染病,流行廣泛,發(fā)病率和病死率較高。近年來,隨著鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,有關(guān)鵪鶉疾病的報道也陸續(xù)增多,但國內(nèi)對鵪鶉的細(xì)菌性疾病的報道很少。作者對某鵪鶉場進行了流行病學(xué)調(diào)查及病原微生物分離與鑒定,試圖為今后鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的防病治病工作提供參考和借鑒。

該場2009年4月從育雛舍到育成舍陸續(xù)發(fā)病,發(fā)病率為20%～30%,死亡率為10%,病鵪鶉表現(xiàn)為精神沉郁,羽毛松亂,排灰白色或綠色稀便。剖檢變化表現(xiàn)為肝臟土黃色或綠色,部分腸道脹氣?？诜h(huán)丙沙星,病情有所好轉(zhuǎn),一旦停藥則病情加重。該場疫情不斷,造成了很大的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

40日齡～58日齡病死鵪鶉的肝臟和心血,并在水井、禽舍輸水系統(tǒng)采取2份水樣。

麥康凱(MacConkey)瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司;伊蛋白大豆瓊脂(TSA)和伊蛋白大豆肉湯(TSB)購自碧迪醫(yī)療器(上海)有限公司;普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯為自制;生化試驗微量發(fā)酵管購自杭州微生物試劑有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

小鼠購自湖北省實驗動物研究中心。購買回來后飼養(yǎng)7 d,無任何發(fā)病癥狀,用于后續(xù)試驗。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 無菌操作取2份臟器(編號為QS0901、QS0902)直接劃線于TSA和麥康凱瓊脂平板上,無菌操作分別取水樣(編號為 WS0901、WS0902)0.2 mL于 TSA和麥康凱瓊脂平板上。37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。從其中挑取可疑菌落,進行革蘭染色,鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌的純培養(yǎng) 從TSA上挑取灰白色、光滑的菌落在新的TSA上劃線,37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果,再次染色、鏡檢。若菌體形態(tài)和染色特性符合沙門菌的形態(tài)和染色特性時,挑取剩余的半個菌落接種于TSA斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,然后取出置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化特性鑒定 將分離的4個菌株,接種于TSB,37℃培養(yǎng)24 h后適量地接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、衛(wèi)矛醇、H2S、靛基質(zhì)微量發(fā)酵管,置37℃培養(yǎng)24 h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。靛基質(zhì)滴加靛基質(zhì)試劑,置37℃培養(yǎng)2 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 小鼠致病性試驗 取4株細(xì)菌的18 h TSB培養(yǎng)物(菌液濃度為2.0×108cfu/mL),經(jīng)純粹檢驗合格,分別腹腔接種18 g～25 g小鼠,按0.2 mL/只劑量接種,每個菌株接種6只。對照組經(jīng)相同的途徑接種0.2 mL TSB,接種3只。接種后飼養(yǎng)觀察7 d,記錄小鼠的死亡時間并從死亡小鼠的肝臟、心臟分離致病菌。

1.2.5 藥物敏感性試驗 按世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的Kirby-Bauer法對4株分離菌株進行藥敏試驗[1]。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑大于15.1 mm為高度敏感,10.1 mm～15 mm為中度敏感,0 mm～10 mm為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

從臟器中分離的細(xì)菌經(jīng)37℃培養(yǎng) 24 h,在TSA上長出圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、直徑1.0 mm～2.0 mm的灰白色菌落;在麥康凱瓊脂上長出圓形、表面光滑、邊緣整齊、直徑 0.5 mm～1.0 mm的無色菌落;在TSB中呈均勻混濁,管底有灰白色的沉淀,輕搖試管時,沉淀物呈絮狀慢慢升起。取培養(yǎng)物涂片,革蘭染色,鏡檢可見到革蘭陰性、無芽孢、中等大小短桿菌,單獨或成雙存在。水樣中的分離菌與臟器分離菌的菌落及形態(tài)學(xué)特征相同。

2.2 分離菌的生化特性

選擇蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、靛基質(zhì)、H2S、衛(wèi)矛醇微量發(fā)酵管對分離出的4株細(xì)菌進行生化試驗。由表2可知,臟器和水樣中分離的細(xì)菌均發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖、木糖,不發(fā)酵蔗糖和乳糖,不形成靛基質(zhì),不產(chǎn)生H2S,不同的是臟器中分離菌株發(fā)酵衛(wèi)矛醇,而水樣中分離的細(xì)菌不發(fā)酵衛(wèi)矛醇(表1)。

表1 鵪鶉沙門菌分離株的生化試驗Table 1 The results of biochemistry test forSalmonella isolate from quail

2.3 小鼠致病性試驗

接種分離菌編號為QS0901和QS0902的小鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振,18 h開始出現(xiàn)死亡,48 h全部死亡。剖檢死亡的小鼠可見肝臟腫大淤血,表面散在針尖大小的出血點,心包膜有不同程度的出血。從死亡小鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。接種分離菌編號為WS0901和WS0902的小鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振,48 h內(nèi)各死亡2只,48 h～72 h又各死亡2只,另4只存活小鼠1周后剖殺,從死亡、迫殺小鼠肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小鼠健康,剖檢無肉眼可見病理變化,肝臟、心臟中未分離出分離菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

對分離菌株進行了藥敏試驗,臟器中分離的細(xì)菌對強力霉素、多黏菌素B高度敏感,對卡那霉素、環(huán)丙沙星中度敏感,對新霉素、氨芐青霉素、萬古霉素、頭孢膚肟、慶大霉素、頭孢噻吩、磺胺異噁唑、恩諾沙星耐藥;水樣中分離的細(xì)菌對卡那霉素高度敏感,對其他藥物不敏感(表2)。

表2 抗菌藥敏紙片對鵪鶉沙門菌分離株抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zone diameter of antibacterial drugs in sensitive slips for Salmonella isolate from quail mm

3 討論

禽沙門菌病是由沙門菌引起的傳染病,沙門菌為條件致病菌。據(jù)現(xiàn)場調(diào)查和流行病學(xué)分析,此次疫病的發(fā)生與環(huán)境、水源及鵪鶉抵抗力下降有直接關(guān)系,在水井、禽舍飲水乳頭兩處水樣中均檢出了沙門菌。同時該場從育雛舍到育成舍,均未實行全進全出制,環(huán)境衛(wèi)生不良,通風(fēng)不佳,飲水更換不勤,加上環(huán)境消毒不嚴(yán),導(dǎo)致病原菌的迅速大量繁殖。通過流行病學(xué)調(diào)查、癥狀分析、剖檢變化觀察、分離病原體的生化試驗及動物接種試驗,均為沙門菌感染。

隨著集約化程度的不斷提高,細(xì)菌性疾病的增多,抗菌類藥物的廣泛使用,尤其是低劑量添加入飼料中,使一些致病菌株產(chǎn)生了很強的耐藥性,而且細(xì)菌可通過質(zhì)粒把耐藥基因傳遞給其他沙門菌,使得沙門菌的耐藥性形成較快,環(huán)境中沙門菌的耐藥性菌株越來越多[2-8],導(dǎo)致臨床上的無效治療。本次試驗對分離鑒定的4株沙門菌進行藥敏試驗結(jié)果顯示,從臟器中分離的細(xì)菌對強力霉素、多黏菌素B高度敏感,對卡那霉素、環(huán)丙沙星中度敏感,對新霉素、氨芐青霉素、萬古霉素、頭孢膚肟、慶大霉素、頭孢噻吩、磺胺異噁唑、恩諾沙星耐藥;水樣中分離的細(xì)菌對卡那霉素敏感,對其他藥物不敏感。由此可見,在養(yǎng)殖場中要定期分離病原,進行耐藥性監(jiān)測,監(jiān)督耐藥性的發(fā)展和變化,以指導(dǎo)臨床正確用藥[6-7]。在實際用藥中應(yīng)采取聯(lián)合、輪換、交叉等用藥形式,以減小細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的幾率,達(dá)到好的防治效果。同時,食源性動物耐藥菌可通過多種途徑將耐藥基因傳遞給人類致病菌,危害人類健康[9-11],所以要有法規(guī)來規(guī)范獸藥的使用。該場使用強力霉素對本病進行了治療,并采用對飲水進行嚴(yán)格消毒等措施,有效地控制了疫病的暴發(fā)和流行。

[1]馬興樹.禽傳染病實驗診斷技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:279-282.

[2]鄧樹軒,程安春,汪銘書,等.沙門氏菌耐藥機制研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(23):7205-7207.

[3]陳仗榴,吳聰明,蔣紅霞.獸用抗菌藥物耐藥性研究概況[J].四川生理科學(xué)雜志,2005,27(4):177-180.

[4]張永利,萬獻(xiàn)堯.細(xì)菌耐藥性研究進展[J].中國醫(yī)師雜志,2004,6(12):1721-1722.

[5]Mitcheu L.Drug resistant Salmonella in the United States.An epidemiologic perspectile[J].Science,1986,234(21):964-969.

[6]潘志明,焦新安,劉文波,等.雞白痢沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2002,33(4):377-383.

[7]雷連成.細(xì)菌耐藥性[J].中國獸藥雜志,2002,36(11):41-44,49.

[8]甘孟侯.家禽細(xì)菌性疫病的發(fā)生與防治對策[J].中國獸醫(yī)雜志,1996,22(6):40-43.

[9]趙紅梅,金升藻.濫用抗生素對人畜的危害及對策研究[J].國外醫(yī)藥:抗生素分冊,2003,24(4):164-167.

[10]高 光.畜禽食源性細(xì)菌耐藥性與食品安全、現(xiàn)狀與對策//二十一世紀(jì)獸藥與食品安全論壇論文集[C].北京:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,2002:57-68.

[11]Baskerville A.Ariborne infection of laying hens with Salmonella enteritidis phage type 4[J].Vet Rec,1992,130(18):395-397.