吳 瓊，王 炎，周利紅，劉寧寧，孫 玨，范忠澤，李 琦

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腫瘤科，上海 200062）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤的第2位，發(fā)病率居惡性腫瘤第4位［1］。在我國(guó)，胃癌的死亡率居惡性腫瘤首位，其發(fā)病率居惡性腫瘤第2位［2-3］，嚴(yán)重危害著人民的生命和健康。目前胃癌的治療首選手術(shù)，但復(fù)發(fā)率高、5年生存率低［4］。中醫(yī)中藥、中西醫(yī)結(jié)合治療因其療效確切、毒副作用較低凸顯了重要意義［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究健脾解毒方誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4 w～6 w齡SPF級(jí)BALB/c裸小鼠60只，雌雄各半，體重18 g～22 g。由中科院上海藥物研究所提供。

1.1.2 藥物與試劑 人胃低分化腺癌MKN-45細(xì)胞株引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（含青霉素、鏈霉素各 100 U/mL）中，37 ℃ 、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)體外、體內(nèi)傳代，形成穩(wěn)定的皮下移植瘤模型，體內(nèi)第3代移植瘤為瘤種；健脾解毒方（由生黃芪、生白術(shù)、木香、野葡萄藤、半枝蓮等組成），含生藥26.6 g/支；替加氟，上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司華聯(lián)制藥廠（批號(hào)：070405）。RPMI Medium1640培養(yǎng)基（Gibico 公司）；小牛血清（Gibico 公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；青霉素、鏈霉素 （華北制藥有限公司）。 RNAiso （Takara 公司）；DEPC （Sigma 公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）；DNA 原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒；鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化酶（SP）免疫組化染色超敏試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞株MKN-45，將細(xì)胞消化后收集到離心管中，然后用磷酸緩沖液（PBS）制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液。按2×106個(gè)/0.2 mL的細(xì)胞數(shù)量接種到裸小鼠的右前肢的腋部皮下。經(jīng)過(guò)7 d～10 d，待皮下腫瘤生長(zhǎng)至直徑約1 cm～1.2 cm左右，選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)破潰的荷瘤鼠作為供瘤鼠，剝離皮下腫瘤組織，取腫瘤邊緣新鮮的腫瘤組織，剪碎至1 mm3大小的組織塊，在超凈臺(tái)用20號(hào)套管針接種于裸小鼠背部右側(cè)近前肢皮下［4］，傳至第 3 代為模型。

1.2.2 分組與給藥 腫瘤接種約10 d后，選擇腫瘤直徑達(dá)到5 mm左右、瘤體生長(zhǎng)良好、無(wú)自發(fā)出血壞死、瘤周無(wú)感染病灶的荷瘤鼠48只為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將所選裸小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、替加氟組、健脾解毒方組、聯(lián)合用藥組4組，每組12只。空白對(duì)照組灌胃生理鹽水0.5 mL/d，替加氟組灌胃替加氟100 mg/（kg·2 d），健脾解毒方組灌胃健脾解毒湯 40 g/（Kg·d），聯(lián)合用藥組灌胃健脾解毒湯40 g/（Kg·d）和替加氟100 mg/（kg·2 d），共計(jì) 14 d。

1.2.3 抑瘤率和模型生存期的觀察 給藥14 d后，各組隨機(jī)取裸鼠6只，脫頸處死，酒精浸泡30 s消毒后，迅速剝離瘤體，稱(chēng)取瘤重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率［7］。

自治療結(jié)束次日起觀察各組余下6只荷瘤鼠的生存天數(shù)，記錄生存時(shí)間，并計(jì)算生命延長(zhǎng)率［7］。

1.2.4 TUNEL染色法檢測(cè)裸鼠人胃癌組織細(xì)胞凋亡指數(shù) 采用dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù) （terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabeling，TUNEL，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。以陽(yáng)性對(duì)照片（替加氟組）為參照系，判斷標(biāo)準(zhǔn)為避開(kāi)壞死區(qū)細(xì)胞核有明顯棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞［7］。隨機(jī)選10個(gè)高倍視野（×400），借助網(wǎng)格記數(shù)器，細(xì)胞數(shù)大于1 000個(gè)以上，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)（TUNEL labeling index，TUNEL-LI），即凋亡指數(shù) AI［8］。

1.2.5 Q Real-time PCR方法測(cè)定Bcl-2、Bax基因的mRNA表達(dá) 取各組腫瘤組織抽提總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax基因的mRNA表達(dá)。 相對(duì) mRNA表達(dá)=2-△Ct，△Ct值=靶基因 Ct值－GAPDH Ct值。

人GAPDH、Bcl-2、Bax上、下游引物和探針由上海閃晶生物公司設(shè)計(jì)并合成，其中5′端標(biāo)記上報(bào)告熒光基團(tuán) FAM（6-carboxy-fluo-rescein-phosphoramidite），3′端標(biāo)記上淬滅熒光基團(tuán) TAMRA（carboxy-tetramethyl-rhodamine）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 GAPDH、Bcl-2、Bax探針引物序列

1.2.6 免疫組化技術(shù)測(cè)定Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)采用鏈霉菌抗生素蛋白－過(guò)氧化酶（S-P）免疫組化染色方法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。計(jì)數(shù)采用雙盲法。

采用圖像分析儀，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為在組織胞漿和 （或）胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為Bcl-2陽(yáng)性標(biāo)志；胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為Bax陽(yáng)性標(biāo)志。每張切片于高倍鏡下（×400）任選10個(gè)視野，細(xì)胞數(shù)大于1000個(gè)以上，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，陽(yáng)性計(jì)數(shù)采用雙盲法，以陽(yáng)性率作為觀察指標(biāo)［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用PEMS3.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（±s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，多組資料間的比較采用單因素方差分析法；組間兩兩比較用采用SNK-q檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls法）；檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 健脾解毒方對(duì)裸鼠胃癌的抑制作用

結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 給藥后各組腫瘤大小比較

表2 治療后各組腫瘤組織瘤體重量及抑瘤率比較

由表2可以看出，與空白對(duì)照組比較，健脾解毒方組能顯著抑制瘤體生長(zhǎng) （P<0.01），抑瘤率為57.04%；聯(lián)合用藥組瘤體重量最?。≒<0.01），其抑瘤率達(dá)到83.10%，優(yōu)于替加氟組和健脾解毒方組（P<0.05，P<0.01），提示健脾解毒方能抑制裸鼠胃癌生長(zhǎng)，聯(lián)合用藥有增效作用。

2.2 健脾解毒方對(duì)胃癌裸鼠生存期的影響

空白對(duì)照組荷瘤裸鼠生存期最長(zhǎng)9 d，最短5 d，平均7.3 d；替加氟組荷瘤裸鼠生存期范圍8 d～14 d，平均10 d，生命延長(zhǎng)率為36.36%；健脾解毒方組荷瘤裸鼠生存期范圍11 d～18 d，平均13.83 d，生命延長(zhǎng)率為88.66%；聯(lián)合用藥組荷瘤裸鼠生存期最長(zhǎng)，范圍12 d～22 d，平均16.33 d，生命延長(zhǎng)率為122.72%，提示健脾解毒方能夠延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存期，聯(lián)合用藥有增效作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 治療后各組荷瘤裸鼠生存天數(shù)及生命延長(zhǎng)率比較 （±s）

表3 治療后各組荷瘤裸鼠生存天數(shù)及生命延長(zhǎng)率比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01

組別 n 生存期（d）生命延長(zhǎng)率（%）生理鹽水組 6 7.33±1.63 -替加氟組 6 10.00±2.28 36.36健脾解毒方組 6 13.83±2.481） 88.66聯(lián)合用藥組 6 16.33±3.931） 122.72

2.3 健脾解毒方對(duì)裸鼠胃癌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

表4 治療后各組腫瘤組織凋亡指數(shù)比較 （±s）

表4 治療后各組腫瘤組織凋亡指數(shù)比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01；與聯(lián)合用藥組比較，2）P<0.01

聯(lián)合用藥組 645.67±5.031）

圖2 治療后各組胃癌細(xì)胞凋亡情況（TUNEL×400倍）

由表4可以看出，與空白對(duì)照組比較，替加氟組、聯(lián)合用藥組和健脾解毒方組凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.01）。而聯(lián)合用藥組凋亡指數(shù)優(yōu)于替加氟組和健脾解毒方組（P<0.01）。提示健脾解毒方能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥有增效作用。

2.4 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，健脾解毒方組Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P<0.01），Bax mRNA水平明顯上調(diào) （P<0.01），Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 （±s）

表5 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01

健脾解毒方組 6 0.227±0.0381.332±0.0820.17

2.5 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

Bcl-2表達(dá)主要在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，染色呈棕褐色或棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，健脾解毒方干預(yù)后Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）；Bax表達(dá)主要在細(xì)胞漿，染色呈棕褐色或棕黃色顆粒，與空白對(duì)照組比較，健脾解毒方干預(yù)后Bax表達(dá)明顯上調(diào)，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2/Bax比值明顯下降，與熒光定量PCR方法檢測(cè)的mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)果見(jiàn)表 6，圖 3、圖 4。

表6 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)率的影響 （±s）

表6 健脾解毒方對(duì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)率的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01

組別 n Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白對(duì)照組 6 9.50±2.86 7.51±2.27 3.322健脾解毒方組 6 5.06±1.661） 22.10±5.191） 0.229

圖3 空白對(duì)照組和健脾解毒方組腫瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)情況（SP×400）

圖4 空白對(duì)照組和健脾解毒方組腫瘤組織Bax蛋白表達(dá)情況（SP×400）

3 討 論

本研究論證了健脾解毒方在體內(nèi)具有一定的抗胃癌作用，抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的生存期，并且聯(lián)合替加氟作用更強(qiáng)，提示健脾解毒方能為化療藥物增效、提高荷瘤裸鼠對(duì)化療藥物的耐受性。

健脾解毒方由生黃芪、生白術(shù)、木香、野葡萄藤、半枝蓮等組成，應(yīng)用于臨床能夠顯著改善胃癌患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期［10-11］。胃癌的病變過(guò)程復(fù)雜多變，但其根本在于脾胃氣虛。脾胃為后天之本，氣血生化之源，在胃癌的治療中，健脾和胃是根本。早在宋元期間成書(shū)的 《衛(wèi)生寶鑒·卷十四》云：“養(yǎng)正積自除，……令真氣實(shí)，胃氣強(qiáng)，積自消矣”，將扶正固本放在其治療的首位。本研究為益氣健脾、理氣解毒法抗癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）指的是在生理或某些病理?xiàng)l件下由基因控制的一種單個(gè)細(xì)胞溫和死亡形式，其正常發(fā)生調(diào)控著機(jī)體正常的生理活動(dòng)，對(duì)機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)和組織器官正常生理功能有重要意義［12］。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)生也與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，是凋亡機(jī)制受到抑制不能正常清除異常細(xì)胞的結(jié)果［13］。因此，臨床上抗癌藥物、化療、放療等主要作用機(jī)制之一都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到治療目的。

本研究探討了健脾解毒方在體內(nèi)抗胃癌和延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存期作用；誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用，提示健脾解毒方誘導(dǎo)裸鼠胃癌細(xì)胞凋亡可能是其抗胃癌的機(jī)制之一。

Bcl-2蛋白家族是目前研究比較多的凋亡相關(guān)蛋白。目前已經(jīng)鑒定出的Bcl-2蛋白家族有20余種，根據(jù)它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的作用可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是抗凋亡蛋白，包括 Bcl-2、Bcl-x1、Bcl-1 等；另一類(lèi)是促凋亡蛋白，包括 Bax、Bak、Bid、Bad 等。它們的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的凋亡或生存。其中，Bcl-2、Bax是該家族中較為重要的兩個(gè)功能相反的蛋白。二者比值對(duì)于細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激后存活與否起關(guān)鍵性作用。免疫組化和熒光定量PCR方法檢測(cè)健脾解毒方干預(yù)后Bcl-2、Bax的蛋白和mRNA表達(dá)情況，結(jié)果趨勢(shì)一致，Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)、Bcl-2/Bax比值下調(diào)，提示健脾解毒方抗胃癌作用與其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控Bcl-2、Bax表達(dá)有關(guān)。

［1］Brenner H，Rothenbacher D，Arndt V.Epidemiology of stomach cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472（2）：467-477.

［2］周岱翰.臨床中醫(yī)腫瘤學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：159-166.

［3］張思維，陳萬(wàn)青，雷正龍，等.中國(guó)腫瘤登記處2004年惡性腫瘤發(fā)病資料分析［J］.中國(guó)腫瘤，2008，17（11）：909-912.

［4］李連勇，劉慶森.胃癌化療方案研究及策略進(jìn)展［J］.腫瘤防治研究，2006，33（7）：536-539.

［5］劉佛添.胃癌的中醫(yī)藥治療進(jìn)展［J］.淮海醫(yī)藥，2009，27（1）：87-89.

［6］曾暉，鄒冰，譚慧珍，等.苦參堿聯(lián)合5-FU抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)作用及機(jī)制 ［J］. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（2）：164-171.

［7］王炎，李琦，馮年平，等.丹參酮ⅡA納米粒治療小鼠肝癌及其對(duì)Cyclin E 表達(dá)的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（9）：74-77.

［8］李琦，王炎，范忠澤，等.丹參酮ⅡA及其納米粒誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及對(duì) p38MAPK、TGFβ1信號(hào)蛋白表達(dá)的影響［J］. 腫瘤，2008，28（1）：8-12.

［9］趙愛(ài)光，楊金坤，尤圣富，等.中藥WCA對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC27901體內(nèi)作用基因的篩選與驗(yàn)證［J］. 中國(guó)中藥雜志，2008，32（19）：2 036.

［10］許建華，李朝衡，朱美華，等.健脾解毒方口服液抗腫瘤作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2004，20（4）：42-44.

［11］許建華，范忠澤，孫玨，等.健脾解毒方治療晚期胃腸癌及對(duì)外周血 MDRmRNA 的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（5）：40-42.

［12］Radovic′N(xiāo)，Cucic′S，Altarac S.Molecular aspects of apoptosis［J］.Acta Med Croatica，2008，62（3）：249-256.

［13］Tait J F.Imaging of apoptosis［J］.J Nucl Med，2008，49（10）：1 573-1 576.

［14］Call J A，Eckhardt S G，Camidge D R.Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment［J］.Lancet Oncol，2008，9（10）：1 002-1 011.