譚麗麗，燕正民，徐亞英，楊繼峰，王 勇*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省豐禾玉米研究所，黑龍江 雙城 150100）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是茄科番茄屬（Lycopersicon）植物，也是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一種重要的模式植物。在進行分子生物學(xué)研究時，常常需從番茄葉片中提取純度高、完整性好的RNA。但由于酚類、多糖和蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)和RNase的廣泛存在，使獲得純度較高的番茄葉片總RNA變得十分困難。RNase活性很強，在整個試驗過程中，無論內(nèi)源RNase還是外源RNase即使微量都會使提取的RNA發(fā)生降解。酚類物質(zhì)在細胞破碎時被釋放出來，被氧化后可以與核酸不可逆地結(jié)合導(dǎo)致RNA的活性喪失，降低RNA的質(zhì)量[1]。而多糖是影響RNA提取的另一個難題，多糖在水中的理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中往往會與RNA形成難溶的膠狀物共同沉淀下來，常規(guī)提取方法難以將它們分開，而且在除去多糖的同時RNA也會被帶走，造成RNA產(chǎn)量的降低[2]。因此，在RNA提取過程中我們必須抑制RNase活性、克服次生代謝物質(zhì)的干擾，從而得到質(zhì)量較好、純度較高的RNA。本試驗選擇三種常用的RNA抽提試劑（盒）進行了系統(tǒng)比較分析，發(fā)現(xiàn)改進Trizol法是一種簡單、快速、高效抽提番茄葉片總RNA的好方法。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄長花柱突變體T431，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。

1.2 主要試劑

RNA plant Reagent（天根公司產(chǎn)品）；UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒（上海生物工程公司產(chǎn)品）；Trizol（Invitrogen公司產(chǎn)品）。其余生化試劑均為進口及國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 去除RNA酶

試驗所需塑料制品均用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水37℃處理12 h以上，高溫高壓滅菌40 min，180℃烘干后使用；玻璃器皿于180℃干熱滅菌3 h；用于RNA提取的所有配制的溶液（Tris除外）均需經(jīng)0.1%DEPC水處理12 h，高溫高壓滅菌后方可使用；含Tris的溶液用經(jīng)高溫高壓滅菌的0.1%DEPC水處理配制。

1.3.2 總RNA提取

番茄葉片總RNA的提取采用下列三種常用方法，其操作如下。

方法一：RNA plant Reagent植物RNA提取試劑法，參照天根公司試劑說明書進行。

方法二：UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒，參照上海生工試劑盒說明書進行。

方法三：改進Trizol提取法?？俁NA提取按照Invitrogen公司的試劑說明書進行，并加以改進，其不同之處在于：①取0.1 g番茄葉片液氮研磨成細粉后加0.1 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）繼續(xù)研磨，液氮揮發(fā)后，迅速加入Trizol試劑；②在沉淀RNA之前再加入等量的苯酚：氯仿：異戊醇（PCI）=25：24：1，重新抽提一次；③試驗過程中加入的試劑都經(jīng)預(yù)冷。

1.4 總RNA樣品純度、濃度及完整性檢測

1.4.1 電泳分析

分別取2 μL RNA樣品，在1.0%的非變性溴化乙錠（EB）瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。在紫外透射儀下觀察RNA條帶，并照相記錄。

1.4.2 RNA樣品紫外分光光度計檢驗

將用三種方法提取的RNA分別取1 μL稀釋50倍，用紫外檢測儀測定260和280 nm的紫外吸光度A260和A280，每個波長重復(fù)3次，取平均值，計算A260/A280，并計算得率。

得率（μg·g-1）=A260×40（μg·mL-1）×稀釋倍數(shù)×RNA 原液體積（mL）/所取樣品重（g）

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳分析

凝膠電泳是檢驗RNA質(zhì)量的一種重要手段，從電泳膠上不僅可以判斷RNA的完整性和降解程度，也可以判斷有無DNA、蛋白質(zhì)和多糖的污染。三種提取方法所得的RNA在1.0%的非變性凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 番茄葉片RNA凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA samples from tomato leaves

從利用RNA plant Reagent法得到的RNA電泳圖譜（見圖1-a）可以看到亮度很高的28S、18S和5S三條帶，其熒光亮度相近，存在明顯的拖帶現(xiàn)象，表明RNA已嚴(yán)重降解；在點樣孔中有亮斑，說明此方法提取的RNA樣品中含有多糖或蛋白質(zhì)的污染；在28S上方有非常明顯的其他條帶，說明DNA未徹底去除。

從UNIQ-10柱式法得到的RNA電泳圖譜（見圖1-b）可以看到得到的RNA并不完整，只有28S和18S兩條帶，其熒光亮度接近2：1，但紫外燈下檢測其條帶較淡，濃度較低，這與紫外檢測儀檢測結(jié)果相吻合。在點樣孔中有比較亮的條帶，在28S條帶上方也能看見比較微弱的熒光條帶。說明此方法提取的RNA中有DNA、蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)的污染。

從改進的Trizol法得到的RNA電泳圖譜（見圖1-c）所提取的RNA能看見清晰的三條帶，28S和18S的熒光亮度接近2：1。條帶之間清晰無彌散現(xiàn)象，說明所提取的RNA結(jié)構(gòu)較完整，未發(fā)生降解現(xiàn)象，而且加樣孔內(nèi)干凈，表明無蛋白質(zhì)和多糖等其他雜質(zhì)污染，在28S上方也無其他條帶存在，表明此方法提取的RNA去除DNA比較徹底。

綜合比較以上幾種方法，只有改進Trizol法所提取的RNA條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整，可以用于后續(xù)試驗。

2.2 總RNA產(chǎn)量和純度分析

三種方法所提取的RNA產(chǎn)量因方法不同而有所不同（見表1）。

表1 RNA樣品的純度和得率Table1 Yield and quality of RNA sample

從表1可以看出，用RNA plant Reagent法和改進Trizol法提取的番茄葉片總RNA產(chǎn)量相對高一些，其中改進Trizol法獲得的RNA產(chǎn)量最高，約為 445.6 μg·g-1，而用 UNIQ-10 柱式法獲得的RNA產(chǎn)量較低，僅為24.4 μg·g-1，無法進行后續(xù)試驗。從A260/A280可以看出提取RNA的純度，純度較高的RNA溶液A260/A280比值介于 1.7～2.0之間[3]，UNIQ-10柱式法和改進Trizol法提取的RNA溶液A260/A280比值均位于此范圍，而RNA plant Reagent法比值低于該范圍，說明提取的RNA的純度較低，RNA樣品中有蛋白質(zhì)或多糖的污染。

3 討論與結(jié)論

獲得高質(zhì)量的RNA是進行分子克隆及基因表達研究的基礎(chǔ)。目前已有多種植物RNA提取分離的報道[4-7]。但由于RNase的廣泛存在，加之植物組織中或富含酚類、或富含多糖、或富含蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)[5]，給RNA的提取帶來了一定的困難。因而在進行以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)試驗中，應(yīng)根據(jù)植物組織材料的不同特點，選擇適合的RNA提取方法。本試驗通過比較幾種常用RNA的抽提試劑（盒）并進行改進，優(yōu)化出一種簡單、快速、有效的適合提取番茄葉片總RNA的方法，為研究以番茄葉片為材料的試驗提供了理論支持。

Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖，RNA plant Reagent就是利用高濃度的NaCl去除多糖的原理[8]。該方法提取RNA的操作步驟簡便，只需1～2 h，是植物組織提取RNA的首選，而且RNA plant Reagent提取RNA在多種植物中都有成功的報道。胡曉靜等利用RNA plant Reagent法成功提取條斑紫菜絲狀體總RNA[9]；余潔等也用RNA plant Reagent法提取的RNA進行RT-PCR，克隆出與木薯淀粉合成有關(guān)的SBEII基因[10]。本試驗最初也試圖采用RNA plant Reagent快速提取番茄葉片RNA，但電泳和紫外分析儀檢測結(jié)果表明，此種方法并不能有效去除葉片組織中的DNA、蛋白質(zhì)和多糖，而且降解較嚴(yán)重，不能用于逆轉(zhuǎn)錄等后續(xù)試驗。

UNIQ-10柱式法總RNA抽提試劑盒具有提取簡單，快速的特點，在提取過程中只需0.5 h，此試劑盒法提取的RNA條帶清晰，A260/A280的比值為1.75，表明RNA質(zhì)量也較好，但樣品RNA得率僅約24.4 μg·g-1，明顯低于改進后的Trizol試劑法提取RNA的得率。由于提取RNA量太少，因而不能用于后續(xù)試驗。

改進Trizol法根據(jù)番茄葉片中含有較多的酚類化合物的特點，在加入Trizol試劑后迅速加入PVP，PVP是多酚類化合物的螯合劑，使之不能被氧化成醌類，在提取初期就將酚類物質(zhì)去除。多糖則通過在沉淀RNA之前加入PCI的方法來有效降低組織中多糖的含量，從而提高了總RNA的純度。而此方法的另一個不同之處就是在整個試驗過程中加入的試劑都經(jīng)預(yù)冷，增加了RNA沉淀量，提高了RNA得率[11]。通過改進試驗有效地從番茄葉片中提取了純度較高、完整性較好的RNA，排除了多糖、蛋白質(zhì)和酚類等次生代謝物質(zhì)的污染。經(jīng)紫外光譜分析A260/A280比值為1.88，電泳28S、18S和5S三條條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整，可用于逆轉(zhuǎn)錄、RTPCR、Northern blot等分子生物學(xué)研究。

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