趙爾豐，高 暢，高 欣，程大海

（哈爾濱市第三中學，哈爾濱 150001）

藍莓（Vaccinium vitisidaea）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）多年生落葉或常綠灌木。藍莓原產(chǎn)北美洲，是地球上少有的真正藍色食物之一。藍莓果實集營養(yǎng)保健于一身，果皮中富含的活性物質(zhì)—花青素，具有很強的抗氧化、抗腫瘤、增強心血管功能等作用[1-3]。此外，藍莓花青素對改善人的弱視具有專一的功效[4－5]。藍莓適于鮮食，更適于加工成果汁飲料、果酒飲品等[4-6]。據(jù)報道只有13%～23%的花青素在于巴氏殺菌的藍莓果汁中，而大約42%存留在果渣中[7]；我國的藍莓商品化主要為初級加工產(chǎn)品，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的廢棄果渣[8]。因此，為了更加充分利用藍莓花青素資源，有必要對藍莓果渣中花青素的提取工藝進行研究，從而獲得一種高效、節(jié)能、安全的藍莓果渣中花青素提取方法。

目前，藍莓中花青素的提取方法有水提取、有機溶劑提取、超臨界流體提取和酶輔助提取等方法。水提法成本低，但提取率差，原料利用率不高，資源浪費嚴重；有機溶劑易對環(huán)境及操作者產(chǎn)生危害；超臨界流體法雖提取率高，但因設備昂貴，普及受限制[9-10]。已經(jīng)報道的酶輔助提取方法較多，但多在強酸性條件下實施，對于藍莓資源深入應用有極大的制約。為此，本研究以超聲波為動力，利用酶解方法提取藍莓果渣中花青素。本法操作簡便，提取效率高，為藍莓資源充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

藍莓購自大興安嶺地區(qū)加格達奇市。

1.2 儀器與試劑

多功能勻漿機，SHIMADZU UV-2550型紫外可見分光光度儀，電子天平，DK-9821電子恒溫水浴鍋，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴槽。

纖維素酶（30 U·mg-1）、果膠酶（5 U·mg-1）及中性蛋白酶（15 U·mg-1）（上海賀寶化工有限公司）；95%食用酒精（哈爾濱市釀酒廠）；其他試劑均為分析純試劑。

1.3 酶-超聲波輔助提取工藝參數(shù)單因素優(yōu)化試驗

精確稱取藍莓果渣5 g，加入水于勻漿機中勻漿2 min，將勻漿液轉(zhuǎn)移到具塞三角瓶中，以超聲波為動力，分別考察加入酶的不同類別（果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶及不同復合酶）、超聲波功率（50、100、150、200和250 W）、不同溫度條件（30、40、50和 60℃）、酶用量（2、5、8、10和15 mg·g-1）、培養(yǎng)提取時間（10、15、20、25、30和50 min）對果渣中花青素提取的影響，從而確定最優(yōu)的提取條件。然后，向體系中補充加入95%的食用酒精，進一步超聲波強化提取，提取液經(jīng)離心、過濾后定容，測定花青素含量。

1.4 酶-超聲波輔助提取工藝參數(shù)正交試驗優(yōu)化

上述單因素試驗結(jié)果表明，采用纖維素酶-超聲波輔助提取藍莓果渣最合適，超聲波最適功率為200 W，隨后補充加入乙醇至40%濃度強化提取10 min，在此條件下以酶輔助提取溫度（A）、酶用量（B）、料液比（C）和酶培養(yǎng)時間（D）為考察因素，對提取工藝采用L9（34）正交表進行正交試驗研究，從而確定最佳的提取條件。

1.5 藍莓果渣中花青素含量的測定[11]

取藍莓果渣花青素提取液1 mL，分別加入pH 1.0和pH 4.5緩沖體系，定容至10 mL，分別于530和700 nm測定吸光度，以吸光度表示花青素的提取量，用示差法按照下述公式計算：

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個處理重復3次，取平均值，所得數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行分析，用不同字母表示顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇試驗

以水為溶劑、料液比 1：20（g：mL）、40 ℃條件下，按照15 mg·g-1用量加入不同的酶于150 W超聲波清洗器中培養(yǎng)提取30 min，考察酶種類對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶和三種酶的任意復合酶對藍莓果渣中花青素提取的影響Fig.1 Effect of enzymatic types(cellulase,pactin,neutral protease and complex enzyme)on the extraction of anthocyanins

由圖1可知，加入酶后，藍莓果渣中花青素的提取增加。其中，纖維素酶使花青素的提取增加顯著，果膠酶和中性蛋白酶作用較弱，花青素提取提高不明顯，這與前人報道的酶法從藍莓果或者藍靛果果渣中提取花色苷所得結(jié)果相似。藍莓果渣中大部分是纖維素組成的果皮，纖維素酶的加入可以溫和地分解、破壞細胞壁，加速花青素的釋放。果渣中果膠和蛋白質(zhì)相對很少，使得果膠酶和中性蛋白酶的作用不明顯。同時，上述三種酶的任意復合酶對花青素提取的影響均低于相同用量的纖維素酶，其中，僅纖維素酶和果膠酶的復合酶與單一使用纖維素酶的差別較小，說明果膠酶和纖維素酶之間的協(xié)同作用不明顯，而蛋白酶與纖維素酶之間呈負協(xié)同。因此，選擇單一的纖維素酶進行藍莓果渣中花青素的輔助提取試驗。

2.2 酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取量的影響

以水為溶劑、料液比 1： 20（g： mL）、40 ℃條件下，按照15 mg·g-1用量加入纖維素酶，在不同的超聲波功率條件下（50、100、150、200和250 W）培養(yǎng)提取30 min，酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic incubation power on the extraction of anthocyanins

由圖2可知，花青素的提取量隨超聲波功率的增加而增加，當超聲波功率為200 W時，藍莓果渣中的花青素提取量達到最大，繼續(xù)增加功率，花青素的提取量反而減小。因為適當?shù)某暡üβ士梢源龠M酶與底物的結(jié)合，從而增加提取量，但是過高的超聲波功率可能對目標物質(zhì)、酶以及酶促反應過程造成破壞，導致提取量降低。因此，在本試驗中選擇超聲波200 W功率用于果渣中花青素的纖維素酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取。

2.3 酶輔助提取溫度對花青素提取量的影響

在其他參數(shù)不變的條件下，考察溫度對纖維素酶輔助提取藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對花青素提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction of anthocyanins

由圖3可知，花青素的提取隨溫度的升高而增加，當溫度達到50℃時，藍莓果渣中的花青素提取量達到最大，當溫度升高至60℃時，花青素的提取量繼而減小，試驗結(jié)果與報道的從藍莓果中提取花色苷所用溫度一致[16-18]。因為酶促反應在最適合的溫度條件下速度最快，在較低溫度下，底物的分子熱能較低，酶促反應速度慢，當溫度過高時，酶易變性失活。因此，在本試驗中選擇50℃用于果渣中花青素的纖維素酶輔助提取。

2.4 酶用量對花青素提取量的影響

在以水為溶劑、料液比 1： 20（g： mL）、50 ℃、加入纖維素酶，超聲功率200 W，培養(yǎng)提取30 min的條件下，考察纖維素酶用量對藍莓果渣中花青素提取量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶用量對花青素提取的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the extraction of anthocyanins

由圖4可知，當纖維素酶用量達到5 mg·g-1后，繼續(xù)增加酶用量，花青素的提取量不再增加，因為酶作用的底物量是一定的，當?shù)孜锉幻赋浞肿饔煤?，繼續(xù)增加酶的用量不會導致花青素釋放量的增加。因此，纖維素酶的加入量確定為5 mg·g-1，該用量與李穎暢等[17]提取藍莓果中花色苷的酶用量一致，其原因是纖維素酶主要作用于果皮和果籽。

2.5 料液比對花青素提取量的影響

以水為溶劑、50℃條件下，加入5 mg·g-1纖維素酶，超聲功率200 W，以不同的料液比培養(yǎng)提取30 min，考察料液比對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對花青素提取的影響Fig.5 Effect of solid to liqiud ratio on the extraction of anthocyanins

由圖5可知，花青素的提取量隨料液比的增加而增加，當料液比為1：10時即達到了最大值，繼續(xù)增加至1：20，花青素提取量基本不變，但是當料液比達到1：25時，花青素的提取量開始減少。因為過量溶劑的使用一方面降低了酶的濃度，從而降低了酶與底物的接觸；另一方面導致其他雜質(zhì)的大量提取，從而降低了花青素的提取量。為了操作方便，選擇料液比1：10。

2.6 纖維素酶培養(yǎng)提取時間的確定

以水為溶劑、料液比 1： 10（g：mL）、50 ℃條件下，按照5 mg·g-1用量加入纖維素酶，超聲功率200 W培養(yǎng)提取不同時間，考察培養(yǎng)提取時間對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，花青素的提取隨著培養(yǎng)提取時間的增加而增加，并在20 min時即達到最大，之后基本保持不變。因為纖維素酶與底物的作用需要一定的時間，當酶促反應充分發(fā)生后，酶的效率得到充分利用，繼續(xù)增加時間，花青素的提取不再增加。因此，選擇20 min用于酶培養(yǎng)提取試驗。這一結(jié)果遠遠優(yōu)于相關(guān)報道的2～3 h[16-18]，因為超聲波的作用能夠大大促進酶與底物的接觸，從而實現(xiàn)高效提取。

圖6 培養(yǎng)提取時間對花青素提取的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction of anthocyanins

2.7 超聲波-乙醇強化提取過程中乙醇濃度和時間的影響

為了最大量地提取藍莓果渣中的花青素，對酶培養(yǎng)提取的藍莓果渣進行進一步超聲波-乙醇強化提取。在上述優(yōu)化的酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取的條件下，對乙醇的加入方式、加入量和強化提取時間進行了優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在強化提取過程中，兩種乙醇的加入方式對花青素的提取沒有明顯影響，當體系中乙醇濃度為40%時，強化提取10 min后即可獲得較大的花青素吸光值，繼續(xù)增加體系中乙醇含量或者延長時間對花青素提取沒有明顯的影響。與已有的報道用50%乙醇[19]或80%甲醇[20]提取花青素相比，本試驗采用40%乙醇所得效果更好，并且更安全。因此，為了簡化操作程序，選擇在酶培養(yǎng)提取的體系中直接補充加入乙醇，使得體系中乙醇的最終濃度為40%，在此條件下，強化提取10 min，此時，通過計算可知花青素提取物的得率為4.12%。

2.8 正交試驗分析

正交試驗因素水平與結(jié)果如表2所示。由正交試驗結(jié)果可以看出，影響提取效果的因素排序為A＞D＞C＞B，酶用量對花青素提取量影響最小，方差分析結(jié)果表明，5與8 mg·g-1的酶用量對花青素提取沒有顯著影響，溫度、提取時間和料液比對花青素提取影響較大，因此，取酶用量8 mg·g-1，溫度50℃，料液比1：10，提取時間20 min。

表1 乙醇的加入方式、加入量和強化提取時間對花青素提取的影響Table1 Effect of ethanol addition methods,amounts and extraction time on the extraction of anthocyanins

表2 正交試驗因素水平Table2 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)論

花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[13]，花青素作為一種天然食用色素，具有安全、無毒、資源豐富、藥理作用顯著的特點，在食品、化妝、醫(yī)藥等方面有著巨大的應用潛力[14]。

試驗結(jié)果表明，纖維素酶輔助提取花青素的效果最好，其最佳工藝條件為：溫度50℃，酶用量5mg·g-1，以料液比1：10加入水培養(yǎng)提取20min，然后補充加入乙醇，使得體系中乙醇濃度為40%，強化提取10 min，所得藍莓果渣中花青素的提取率為4.12%。但在使用酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取過程中，需要注意的是花青素的提取率并不是隨著超聲波功率的增加而提高。功率過高反而會造成提取率的下降。

酶-超聲波輔助提取藍莓果渣中花青素的方法是一個利用現(xiàn)代生物技術(shù)和物理技術(shù)進行試驗的方法，具有提取率高、工藝簡單、條件溫和等特點，其應用前景廣闊。

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