劉立新，張羽男，沙靖全*，李 睿

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

柑桔屬蕓香科柑桔亞科，是熱帶、亞熱帶常綠果樹，用作經(jīng)濟(jì)栽培的有3個(gè)屬，枳屬、柑桔屬和金柑屬。

我國(guó)和世界其他國(guó)家栽培的柑桔主要是柑桔屬[1]。一直以來(lái)柑桔作為藥用植物深受中醫(yī)的青睞，桔皮理氣健脾，燥濕化痰；桔絡(luò)通絡(luò)理氣化痰；桔核理氣散結(jié)止痛；桔葉疏肝解郁，行氣散結(jié)，消腫化痰。但對(duì)其功效研究報(bào)道較少，柑桔中富含糖、酸、維生素C、礦物質(zhì)元素，還含有類黃酮、類胡蘿卜素、類檸檬苦素等活性物質(zhì)，其中類黃酮是柑桔中含量最為豐富、種類最多的一類功能活性成分。黃酮類化合物是一類以黃酮為母核的化合物，廣泛存在于植物界中，目前已發(fā)現(xiàn)有5 000多種植物中有黃酮類和異黃酮類物質(zhì)。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，具有高抗氧化性，低毒性，無(wú)不良反應(yīng)，同時(shí)還有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變等保健功能[2]，它是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。本文對(duì)柑桔皮中黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化作用進(jìn)行了研究，為利用柑桔皮工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥用成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取成熟的東莞小葉柑桔外皮，70℃烘干，粉碎，備用。

1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量為98%）（上海生化制劑廠）；硫代巴比妥酸（TBA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇，石油醚，三氯甲烷等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

原料預(yù)先進(jìn)行石油醚脫脂、脫色素，以排除干擾。將柑桔皮粉用索氏提取法（石油醚為抽提劑，85℃水?。┟撝爸苄陨兀?dāng)虹吸管中石油醚提取液無(wú)色時(shí)揮盡桔皮粉中石油醚，烘干，備用。

1.3.2 提取因素及其條件的確定

為全面考察乙醇提取法的工藝參數(shù)及最佳操作條件：確定以乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比、提取溫度L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過測(cè)定柑桔皮供試品中的總黃酮提取率，確定最佳提取工藝條件。試驗(yàn)確定的因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of experiment

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對(duì)照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并加至刻度。分別精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mL 分置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，再加10%硫酸鋁溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得蘆丁溶液濃度（C）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的回歸方程式：y=5.5045x+0.0053，r=0.9974。

1.3.4 提取物中黃酮類化合物含量的測(cè)定

分別取一定量的待測(cè)提取液，置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，再加10%硫酸鋁溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，用紫外分光光度計(jì)，1 cm比色皿在350～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，在510 nm處有最大吸收，故在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定提取物的吸光度。

1.3.5 提取物的精制

采用萃取法對(duì)提取物進(jìn)行精制[3]。稱取柑桔皮粉40 g，在優(yōu)化的最佳提取工藝條件下進(jìn)行提取。然后將提取液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至1/3后將濾液在70℃水浴上蒸干，所得固體加入水20 mL溶解，再加入三氯甲烷20 mL，振搖，轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置，分層，棄去三氯甲烷層，水溶液再加入三氯甲烷20 mL重復(fù)1次，將水層減壓蒸餾，濃縮，再在水浴上蒸至近干，干燥，得精制品，備用。

1.3.6 TBA法測(cè)定柑桔皮黃酮抑制芝麻油的過氧化作用

先將柑桔皮黃酮用無(wú)水乙醇配置成濃度分別為0.20%、0.10%、0.05%的溶液，然后將配置好的黃酮溶液和蒸餾水各4 mL放入不同的具塞試管中，加入4.1 mL體積分?jǐn)?shù)為2.5%芝麻油，8 mL pH 7.5磷酸緩沖液和3.9 mL無(wú)離子水，混勻后置于40℃的培養(yǎng)箱中，每隔24 h取待測(cè)樣品1 mL，加入1 mL 20%的三氯乙酸，混勻，放置15 min后，加入2 mL 0.3%的TBA（用0.5%三氯乙酸配制），于沸水

式中，POV為樣品的過氧化值（mmol·kg-1）；

V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

V2為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

M為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度（mol·L-1）；

m為樣品質(zhì)量（g）。浴中加熱15 min，取出室溫下冷卻后加入4 mL正丁醇，搖勻，于3 000 r·min-1離心15 min，取上層正丁醇液，于532 nm比色測(cè)定樣品的吸光度A值。

1.3.7 柑桔皮黃酮類化合物在豬油中的抗氧化作用

采用烘箱儲(chǔ)藏法測(cè)定提取物對(duì)豬油自氧化的抗氧化能力[4]。稱取粗黃酮粉0.01、0.05、0.20 g，各用4 mL無(wú)水乙醇溶解后分別加到20 g溫?zé)嶝i油中，攪勻，以不加桔皮黃酮粉，僅在20 g豬油中加入4 mL無(wú)水乙醇為對(duì)照樣，在70℃烘箱中強(qiáng)化保存，定時(shí)攪伴，于不同時(shí)間取樣測(cè)定豬油中的過氧化值（POV），并以此來(lái)表示豬油的氧化速度，進(jìn)而衡量柑桔皮黃酮類化合物的抗氧化活性。過氧化值的測(cè)定按滴定法進(jìn)行[5]。

樣品的過氧化值（POV）計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 提取柑桔皮黃酮類化合物的最佳工藝選擇

根據(jù)表1以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、固液比（C）、提取溫度（D）4個(gè)因素為影響因素，以黃酮類化合物提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Result of orthogonal experiment

由表2可以看出，柑桔皮中黃酮類化合物的最佳提取工藝為A3B1C3D3，即乙醇濃度70%，提取時(shí)間1.5 h，固液比1：20，提取溫度80℃。乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比、提取溫度4個(gè)因素對(duì)黃酮類化合物提取率影響的主次順序?yàn)椋汗桃罕?提取時(shí)間>乙醇濃度>提取溫度，且隨料液比和乙醇濃度的增加，提取率增加。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得出該條件下提取出的黃酮類化合物為柑桔皮干重的2.689%。

2.2 柑桔皮類黃酮化合物抑制芝麻油的過氧化作用（硫代巴比妥酸法）

按照硫代巴比妥酸法測(cè)定的吸光度值如表3所示。

表3 不同濃度柑桔皮黃酮溶液與抗氧化性關(guān)系Table3 Relationship between different concentration of flavone of orange peel and antioxidation

TBA法是基于不飽和脂肪酸通過自由基反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化自由基，進(jìn)而氧化生成環(huán)氧化物，后者生成丙二醛，1分子的丙二醛可同2分子的TBA作用生成有色化合物，該有色化合物在530 nm左右有吸收峰[6]。由表3可以看出，添加桔子皮黃酮的溶液較不添加的對(duì)照樣吸光度值低，且添加不同濃度的柑桔皮黃酮溶液所測(cè)得的吸光度值不同，由此可以看出黃酮添加量大的抑制芝麻油的自動(dòng)氧化時(shí)間長(zhǎng)。

2.3 POV值測(cè)定法

不同濃度的黃酮溶液POV值隨時(shí)間變化情況如表4所示。

由表4和圖1可以看出，相對(duì)于對(duì)照樣，柑桔皮中提取的黃酮類化合物對(duì)豬油的自氧化有明顯的抑制作用，即桔皮黃酮粉添加到豬油后，POV值下降。并且隨添加量的增加，抗氧化能力也隨之增強(qiáng)，在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

表4 柑桔皮黃酮對(duì)豬油的抗氧化作用Table4 Antioxidation of flavone of orange peel to lard oil

圖1 不同桔皮黃酮添加量與抗氧化性關(guān)系Fig.1 Relationship between different addition of flavone from orange peel and antioxidation

3 討論

3.1 柑桔皮黃酮類化合物的提取工藝

黃酮類化合物在植物體內(nèi)以苷或苷元的形式存在。在大多數(shù)情況下，用有機(jī)溶劑可將苷或苷元全部提出，提取黃酮類化合物常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，但由于甲醇、丙酮等的毒性較大，因此一般采取乙醇為提取溶劑。李志洲研究了苦瓜中黃酮類化合物的乙醇提取工藝[7]，通過試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件為乙醇濃度90%，提取時(shí)間3 h，固液比1：60，提取溫度70℃，提取率可達(dá)7.128%。本研究以乙醇為溶劑從柑桔皮中提取黃酮類化合物，以固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為影響因素，黃酮類化合物的提取率為2.689%，比沙棗中、金橘皮中黃酮提取率要高。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨料液比的增加，提取效果越好，這是因?yàn)榱弦涸黾?，浸出成分相?yīng)增加，黃酮類化合物在大劑量的溶劑中始終成“稀”溶液的狀態(tài)，利于擴(kuò)散的進(jìn)行；隨乙醇濃度的增加，提取率增加，說明黃酮類化合物醇溶性好；提取時(shí)間太短，黃酮類化合物不能完全浸出，但是時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)由于長(zhǎng)時(shí)間在較高溫度下濃縮黃酮類成分遭到破壞，反而使提取率降低；提取溫度對(duì)黃酮提取率影響較小。

3.2 柑桔皮類黃酮化合物的抗氧化作用

廣泛存在于植物中的黃酮類化合物具有抗?jié)?、抗菌、抗炎、抗氧化、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。崔永明等以POV為指標(biāo)[8]，采用烘箱法研究了甘草總黃酮對(duì)油脂的抗氧化性能。結(jié)果表明，甘草總黃酮對(duì)四種食用油脂（菜籽油、大豆油、花生油、豬油）均有良好的抗氧化效果，且對(duì)豬油具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系；楊建雄等用硫代巴比妥酸法研究柿葉黃酮的抗氧化效果[9]。結(jié)果表明，柿葉黃酮可以抑制·OH所致丙二醛的產(chǎn)生，減輕肝線粒體膨脹程度。本研究通過利用所提取的黃酮類化合物對(duì)芝麻油和豬油進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加柑桔皮黃酮類化合物的芝麻油與TBA反應(yīng)后其吸光度降低，表明TBA染料生成得少，說明抗氧化作用抑制了自由基鏈反應(yīng)的進(jìn)行。在測(cè)定POV值試驗(yàn)中添加黃酮粉后在開始階段，相對(duì)對(duì)照樣而言，各樣品的POV值皆下降，表現(xiàn)出明顯的降低豬油中過氧化值的作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抗氧化性減弱，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間處于高溫下，黃酮類化合物的成分遭到破壞而造成的。柑桔皮類黃酮化合物之所以能表現(xiàn)出良好的抗氧化作用可能是因?yàn)辄S酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu)，能夠提供活潑的氫質(zhì)子與油脂氧化產(chǎn)生的自由基結(jié)合成穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻止油脂的氧化反應(yīng)循環(huán)。

4 結(jié)論

柑桔皮中黃酮類化合物的含量較高，在乙醇濃度70%，提取時(shí)間1.5 h時(shí)，固液比1：20，提取溫度80℃的條件下提取的黃酮類化合物為柑桔皮干重的2.689%，比沙棗、金橘皮中黃酮類化合物含量高。柑桔皮黃酮類化合物能阻斷油脂的自氧化過程，具有良好的抗氧化作用的能力。可將其應(yīng)用于抗衰老，抗高血脂藥物研究中，進(jìn)一步開發(fā)其藥用價(jià)值。

[1]葉興乾.柑桔綜合加工利用[M].1版.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005:13-25.

[2]孔琪,吳春.菊花黃酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草藥,2004,35(9):1001-1002.

[3]陳乃富,張莉.蕨菜黃酮類化合物的提取與分析[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2004(6):1-4.

[4]陳乃富.蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(11):63-66.

[5]趙新淮,張娜,王琳.油脂過氧化值的碘量測(cè)定法比較研究[J].中國(guó)油脂,2003,28(4):60-62.

[6]于晶,郝再彬,蒼晶,等.黃酮類化合物的活性研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(12):125-130.

[7]李志洲.苦瓜中黃酮類化合物的提取及抗氧化性研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2007,28(4):264-266.

[8]崔永明,余龍江.甘草總黃酮對(duì)油脂抗氧化作用研究[J].食品科學(xué),2007,28(11):119.

[9]楊建雄,原江鋒.柿葉黃酮的體外抗氧化作用研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,25(2):215.