晉 利,劉兆普,趙耕毛,汪 輝,陳 雷

(南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

一株溶藻細菌對銅綠微囊藻生長的影響及其鑒定

晉 利,劉兆普*,趙耕毛,汪 輝,陳 雷

(南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,江蘇省海洋生物學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

從山東黃島邊某富營養(yǎng)化池塘中分離得到1株具有溶藻作用的菌株(J1),研究了其對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制效果、作用方式以及細菌培養(yǎng)基、菌株與銅綠微囊藻不同生長階段等因素對溶藻效果的影響,并對該菌株進行了生理生化鑒定.結果表明,將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加入藻液,培養(yǎng)基與藻液的投放體積比為6%時,9d內對藻的生長無影響.將初始濃度為6×107cfu/mL的菌液加入藻液,共培養(yǎng)第9d,銅綠微囊藻的去除率達87%以上.對數期的J1細菌具有較好的溶藻效果,作用于穩(wěn)定期銅綠微囊藻的實驗組,藻的去除率較低.J1通過分泌溶藻物質的間接作用方式抑制銅綠微囊藻的生長,且溶藻活性物質具有一定的熱穩(wěn)定性.根據生理生化及16S rDNA序列分析鑒定,菌株J1屬于芽胞桿菌屬(Bacillus).

溶藻細菌；銅綠微囊藻；溶藻作用；16S rDNA；芽胞桿菌

Abstract：An algae-lysing bacterium strain named J1 was isolated from an eutrophic pond around Huangdao. The lytic efficiency and performing mode of bacterial lysing of Microcystis aeruginosa were studied. Influences of the bacterial culture medium and the growth phases of bacterium and algae on the antialgal effect were also studied, and then the bacterium strain was physiologically and biochemically identified. The results showed that algae growth was relatively stable with adding beef-protein medium without bacterium strain when the volume ratio of medium to algae solution was 6%. However, more than 87% of Microcystis aeruginosa had been removed by 9 days after adding the beef-protein medium with initial bacterium concentration of 6×107cfu/mL under the same volume ratio. The antialgal efficiency was different to the various growth phages of bacterium and algae. J1 in log growth phase showed the best algae-lysing performance. The removal rate of algae in stable phrase was the lowest under the treatment with J1 in log growth phase. J1 excreted algae-lysing substance to inhibit the algae growth indirectly, and this active inhibitors were heat-stable. According to the morphological and physiological-biochemical characteristics, bacterium J1 was identified as Bacillus.

Key words：algae-lysing bacterium；Microcystis aeruginosa；algae-lytic effect；16S rDNA；Bacillus

富營養(yǎng)化已成為眾多水體普遍存在的環(huán)境問題.利用溶藻細菌作為水華和赤潮防治的生物,已經引起越來越多人的關注[1].部分研究者認為水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關[2].Doucette等[3]曾報道在水華和赤潮的發(fā)生、發(fā)展和消亡過程中,細菌以及細菌與藻類的相互作用是影響藻類生長的關鍵性的調控因素.由于自然界水體中溶藻細菌比率較低[4],分離較困難,目前國內的研究也多處于起步階段.本實驗室從山東黃島邊某富營養(yǎng)化池塘分離出一株具有溶藻作用的菌株 J1,首先研究了細菌液體培養(yǎng)基自身對銅綠微囊藻的抑制效應,并在排除培養(yǎng)基影響的合理體積投入量范圍內,進一步研究了細菌培養(yǎng)液對銅綠微囊藻的抑制效應,同時利用16S rDNA序列分析方法進行鑒定,為更深入地探討藻菌關系、研究溶藻細菌提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種來源及其培養(yǎng)、計量

實驗藻種為銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa) FACHB469,取自中國科學院水生生物研究所藻種保藏中心.藻種經活化后,采用BG11改良培養(yǎng)基[5],在溫度為25℃,光照強度為2500lx,光暗比為12h:12h的條件下培養(yǎng).通過測量葉綠素a(Chl.a)的含量及顯微觀察了解銅綠微囊藻的生長情況,葉綠素a的測量采用丙酮法[6].藻的去除率R定義為:R=(C0-Ce)/C0,式中:C0為對照樣銅綠微囊藻葉綠素a的含量,μg/L;Ce為處理樣銅綠微囊藻葉綠素a的含量,μg/L.

1.2 細菌的分離及其培養(yǎng)、計量

實驗菌種分離自黃島邊某富營養(yǎng)化池塘.從該池塘中采集水樣,按 10%的比例接入培養(yǎng) 14d的銅綠微囊藻藻液中,25℃共培養(yǎng) 7d.取黃化藻液按不同濃度梯度稀釋,采用平板涂布和劃線的方法分離細菌.細菌的培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,置于 30℃,170r/min,搖床培養(yǎng).將各菌株培養(yǎng)液等量加入到銅綠微囊藻藻液中,得到能夠使藻液發(fā)生黃化現象的菌株 J1.細菌的計量采用稀釋平板測數法[7].

1.3 細菌培養(yǎng)基對藻生長的影響

培養(yǎng)銅綠微囊藻至對數生長期,分別取不加入細菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 0,2,4,6,8, 10mL加入100mL處于對數期的藻液中,每組各設3個平行實驗,每隔2d測1次葉綠素a的含量.

1.4 細菌投入量對溶藻效果的影響

將 J1菌株液體培養(yǎng)至對數生長期(107cfu/mL),分別取菌液0,2,4,6,8,10mL加入100mL處于生長對數期的藻液中,各設3個平行實驗,每隔2d測1次葉綠素a的含量.

1.5 J1細菌生長階段對銅綠微囊藻溶藻效果的影響

將J1菌株液體培養(yǎng)至對數期、穩(wěn)定期、衰亡期,分別取處于不同生長階段的菌液6mL加入100mL處于生長對數期的藻液中,菌株的每個生長階段各設3個平行實驗及空白對照,每隔2d測 1次葉綠素a的含量.

1.6 銅綠微囊藻的生長階段對溶藻效果的影響

將銅綠微囊藻液體培養(yǎng)至適應期、對數期、穩(wěn)定期,分別在處于不同生長階段的100mL藻液中加入6mL處于生長對數期的J1菌液,藻液的每個生長階段各設 3個平行實驗及空白對照,每隔2d測1次葉綠素a的含量.

1.7 J1菌株溶解銅綠微囊藻的作用方式

培養(yǎng)細菌至生長對數期,分別取6mL菌體浸提液(細菌培養(yǎng)液經8000r/min,4℃離心10min,棄上清,重復洗滌2～3次,置于70℃,水浴20h)、菌體(細菌培養(yǎng)液經8000r/min,4℃離心10min,棄上清)、高熱處理的菌液上清(菌液經8000r/min,4℃離心10min,取上清液在121℃下處理30min)、離心濾過的菌液上清(離心得上清液再經 0.22μm濾膜過濾)、菌液加入100mL處于生長對數期的藻液中,各設 3個平行實驗及空白對照,每隔 2d測1次葉綠素a的含量.

1.8 細菌生長曲線測定

生長曲線的測定采用比濁法,具體操作參照文獻[7].

1.9 細菌生理及分子鑒定

生理生化鑒定參照文獻[8];16SrDNA序列分析:按Pitcher法提取細菌的基因組總DNA;以提取的 DNA 為模板,采用通用引物進行16SrDNA基因擴增,上游引物為 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反應體系為50μL,包括10×PCR緩沖液 5μL,dNTP(20mmol/L)4μL,引物(25pmol/μL)各2μL,Mg2+(25mmol/L)4μL,菌體DNA (約 50ng/μL)1μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,加水至50μL,反應條件:94℃變性2min;94℃1min,個循環(huán);72℃延伸20min.PCR產物經檢測純化后,送由上海英駿生物技術有限公司完成測序工作.

2 結果

2.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的不同投入量對銅綠微囊藻生長影響的情況如圖1所示,與對照(投入量為0)相比,直至實驗第3d,各瓶藻液葉綠素a含量基本相當.從實驗第6d開始,加入8,10mL培養(yǎng)基的處理組葉綠素 a含量低于對照,觀察加入2,4,6mL培養(yǎng)基的處理組, 9d后才出現這一現象.說明牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與藻液的的投放體積比小于 6%時,短期內(9～10d)對照組與實驗組無顯著性差異(P>0.05),即培養(yǎng)基對銅綠微囊藻的生長無顯著影響.

圖1 細菌培養(yǎng)基投入量對銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.1 The effects of bacterial culture medium volume on Chl.a of Microcystis aeruginosa

2.2 細菌培養(yǎng)液投入量對銅綠微囊藻生長的影響

圖2 細菌培養(yǎng)液投入量對銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.2 The effects of bacterial culture liquid volume on Chl.a of Microcystis aeruginosa

由圖2可見,細菌培養(yǎng)液投入量為 2mL時,直至實驗第9d,藻液葉綠素a的含量仍高于對照,從第 10d開始,細菌培養(yǎng)液處理的藻液中葉綠素a的含量開始顯著下降,表現出對銅綠微囊藻生長的抑制.細菌培養(yǎng)液投入量為4,6,8,10mL的處理組藻液中葉綠素 a的含量在整個共培養(yǎng)期始終低于對照,在實驗第9d時,葉綠素a的含量分別為對照的63.8%、17.0%、16.6%、18.4%,實驗第12d至第15d,葉綠素a的含量繼續(xù)降低,特別是投入量為6,8,10mL菌液的處理組葉綠素a含量幾乎為0.對比圖1、圖2,排除培養(yǎng)基自身對藻生長的影響,本實驗菌液最適投入量為6mL,濃度約為6×107cfu/mL.

2.3 J1細菌和銅綠微囊藻所處生長階段對溶藻效果的影響

圖3 菌株J1和銅綠微囊藻所處生長階段對溶藻效果的影響Fig.3 The effects of the growth phases of bacterium J1 and Microcystis aeruginosa on algicidal effect

實驗表明,處于生長對數期的 J1細菌對銅綠微囊藻溶解效果較好,處于穩(wěn)定期與衰亡期的 J1細菌溶藻效果相當.如圖 3a所示,實驗第9d,J1對數期、穩(wěn)定期、衰亡期處理組藻的去除率分別為87.4%、74.7%、73.2%.同時,處于不同生長階段的銅綠微囊藻,在相同 J1細菌處理下,溶藻效果亦有差異,處于穩(wěn)定期的藻的實驗組,其去除率低于處于適應期與對數期的實驗組.由圖3b可見,實驗第9d,銅綠微囊藻適應期、對數期、穩(wěn)定期處理組藻的去除率分別為92.3%、89.4%、78.6%.

2.4 J1菌株溶藻的作用方式

由圖4可見,相比于對照,J1菌體浸提液、菌體處理組幾乎無溶藻效果,即細菌不是通過與藻細胞直接接觸的方式抑制藻生長.在銅綠微囊藻藻液初始葉綠素 a濃度為 1940μg/L時,第9d,對照組藻液葉綠素 a上升至 3660μg/L,而高熱處理的上清液、離心濾過的上清液、細菌培養(yǎng)液處理組葉綠素 a的含量分別為 620,480, 380μg/L,溶藻效果顯著,即細菌通過分泌到胞外的活性物質間接溶藻,且活性物質具有一定的熱穩(wěn)定性.

圖4 細菌培養(yǎng)液不同處理方式對銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.4 The effects of bacterial culture liquid treated with different methods on Chl.a of Microcystis aeruginosa—◆—對照 —■—菌體浸提液 —●—細菌培養(yǎng)液—×—菌液上清 —＋—高熱處理的菌液上清 —▲—菌體

2.5 J1細菌生長曲線的測定

由圖5可見,細菌的停滯期在2h左右,2h后進入對數生長期,至 34h左右達生長穩(wěn)定期,第49h左右進入衰亡期.

圖5 菌株J1的生長曲線Fig.5 The growth curve of bacteria J1

2.6 J1細菌生理及分子鑒定

J1菌株在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落呈圓形,表面較為干燥、不透明,邊緣略呈鋸齒狀,革蘭氏陽性菌,能夠水解淀粉、油脂和明膠,檸檬酸鹽、甲基紅、伏-普試驗呈陽性,吲哚反應呈陰性.

PCR擴增產物的長度為 1.5kb,其電泳圖譜見圖6.獲得的16SrDNA序列已在GenBank注冊,注冊號為 FJ815201,用 Blast程序對 J1的16SrDNA序列和GenBank中已登陸的16SrDNA序列進行核苷酸序列同源性比較,結果發(fā)現,與多株芽孢桿菌的同源性極高,再結合生理生化指標可以推斷出,實驗菌株屬于芽孢桿菌屬,J1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7.

圖6 J1PCR擴增產物電泳圖譜Fig.6 The amplification of J1 16SrDNA 1為J1菌株,2為陰性對照

3 討論

銅綠微囊藻是引起水華現象的優(yōu)勢藻種之一.溶解銅綠微囊藻的細菌以前也曾有報道.Yamamoto等[9-10]指出,存在于富營養(yǎng)化湖泊中的假單胞菌是湖泊中能夠溶解藍藻的主要菌株,并從湖泊底泥中分離出一株可抑制銅綠微囊藻的鏈霉菌.汪輝等[11]自池塘中分離出一株無色桿菌屬的細菌亦具有良好的溶藻效果.彭超、裴海燕等[12]曾報道芽胞桿菌對銅綠微囊藻有抑制作用.本研究所篩選到的溶藻細菌亦屬于芽胞桿菌屬,對銅綠微囊藻的溶解作用表現為藻液變黃,有少許沉淀,顯微鏡下觀察,藻細胞破碎.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基屬細菌常用培養(yǎng)基,研究表明,在其與藻液投放比為6%時,從實驗第9d之后,才出現此培養(yǎng)基對藻生長的抑制.對比實驗第 12d,培養(yǎng)基處理組與菌液處理組分別為38.8%和95.3%的藻的去除率,說明后者對藻的抑制占主導地位,且直至第 15d,這一抑制優(yōu)勢有增無減,說明菌液對銅綠微囊藻的抑制作用具有很強的持續(xù)性.除菌液投放比為 2%的處理外,其它菌液處理組在實驗初期即表現出較強的抑藻效果,說明溶藻活性物質需要一定的作用濃度.另菌液投放比為6%、8%、10%的處理組,溶藻效果無明顯區(qū)別,說明對于定量藻液,溶藻活性物質有一定的作用飽和濃度.

圖7 菌株J1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree of strain J1

J1菌株對銅綠微囊藻的溶解效果受到菌株及銅綠微囊藻所處生長階段的影響,實驗結果表明,處于生長對數期的細菌具有較好的溶藻效果,處于穩(wěn)定期、衰亡期的細菌,其溶藻效果低于前者,可能是由于細菌對數期生長旺盛,酶活高,分泌胞外溶藻活性物質較多,而這些活性物質在營養(yǎng)物質較少的生長后期作為二次營養(yǎng)物被再次利用,沒有在穩(wěn)定期及衰亡期得到充分的積累;而對處于生長穩(wěn)定期的銅綠微囊藻,該細菌溶藻效果較差,可能因為處于穩(wěn)定期的銅綠微囊藻,相較于適應期和對數期而言,營養(yǎng)物質減少,胞外分泌物增加,對藻起到了一定的保護作用,從而藻的去除率下降,有報道[13]稱,胞外分泌物能夠起到抵抗抗生素、原生動物捕食的保護屏障作用.

溶藻細菌作用方式,一般分為下列 2種情況[14]:直接溶藻,需要細菌與藻細胞直接接觸;間接溶藻,主要包括細菌同藻競爭有限營養(yǎng)或細菌分泌胞外物質溶藻.本實驗通過對細菌及其培養(yǎng)液進行離心,過濾、浸提、高熱處理,得知J1菌株間接溶藻,且分泌到胞外的溶藻活性物質具有一定的熱穩(wěn)定性.目前已報道的細菌胞外殺藻物質主要有以下幾類:蛋白質[15];多肽[16];氨基酸[17];抗生素[5];含氮化合物[18];其他未鑒定的殺菌物質[11].本實驗所涉及的溶藻活性物質有待進一步研究.

4 結論

4.1 J1菌株對銅綠微囊藻有較好的溶解效果,按6%的體積比向藻液中加入菌液,實驗第9d,藻的去除率達 87%以上.J1作用初始濃度應大于2×107cfu/mL,且在一定的菌液濃度范圍內,初始濃度越大,溶藻效果越好.

4.2 J1菌株的生長階段與銅綠微囊藻的生長階段對溶藻效果均有影響,但作用趨勢基本相同.該菌株屬間接溶藻,胞外溶藻活性物質具有一定的熱穩(wěn)定性.

4.3 J1菌株革蘭氏染色陽性,與多株芽胞桿菌的16SrDNA核苷酸序列的同源性極高,屬于芽胞桿菌屬.

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(Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province, College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2010,30(2)：222～227

X172

A

1000-6923(2010)02-0222-06

2009-06-30

國家自然科學基金資助項目(30600086)

? 責任作者, 教授, sea@njau.edu

晉 利(1983-),女,河北張家口人,南京農業(yè)大學環(huán)境與科學學院碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物方面的研究.