鄧建忠 金建華 陸文斌 王芳

江蘇大學附屬武進醫(yī)院腫瘤內科，江蘇 常州 213002

Survivin于1997年由Ambrosini等［1］利用效應細胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)的cDNA在人類基因組庫中篩選克隆，具有抑制細胞凋亡、調控細胞周期及參與血管形成的作用。胃癌因其早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者被確診時病程已至進展期。檢測外周血中Survivin的表達，有可能成為檢測腫瘤轉移及判斷預后的參考指標之一。本研究旨在探討外周血Survivin mRNA 的表達水平與胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2007年10月—2009年6月到江蘇大學附屬武進醫(yī)院腫瘤科、消化內科和外科就診并經(jīng)胃鏡活檢及術后病理確診為胃癌的患者50例(轉移28例，未轉移22例)，同時平行選擇年齡性別相匹配的門診慢性胃炎患者50例，所有患者均知情同意。

實驗組病例為胃癌患者，共50例，其中男性28例(轉移16例，未轉移12例)，女性22例(轉移12例，未轉移10例)。年齡34～72歲(中位年齡58歲)。TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期28例。采用2002年第6版AJCC胃癌TNM分期標準進行分期。對照組病例為胃炎患者，共50例，其中男性30例，女性20例。年齡30～68歲(中位年齡54歲)。

1.2 方法

1.2.1 外周血總RNA的提取、完整性和純度檢測 根據(jù)試劑盒操作說明，應用TRIzol Reagant行提取RNA，所提取的總RNA用紫外分光光度計定量并檢測其純度。A260/A280≥1.8為合格。所提取的總RNA完整性經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。-70 ℃保存待用。

1.2.2 cDNA合成 20 μL反應體系中含：總RNA 1 μg，10×緩沖液2 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，隨機引物100 ng，M-MLV(10 U/μL)2 μL，加DEPC液至20 μL。逆轉錄反應條件為：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，-70 ℃保存待用。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測 利用DNAman軟件設計RT-PCR Survivin和管家基因GAPDH的引物：GAPDH上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，探針序列為5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’；Survivin上游引物為5’-TGCCCCGACGTTGCC-3’，下游引物為5’-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3’，探針序列為5’-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3’。用RT-PCR法檢測患者外周血中Survivin mRNA的表達水平，GAPDH為內參照，PCR試劑盒、引物及探針合成由中山醫(yī)科大學達安基因有限公司提供。50 μL RT-PCR反應體系中含：1×定量緩沖液，200 μm dNTPs，5 UampliTaq Gold，Survivin上、下游引物各600 nmol/L，熒光探針200 nmol/L，100 ng cDNA，反應條件為：50 ℃10 s，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃1 min，共40個循環(huán)。PCR反應結束后，根據(jù)

標準曲線儀器自動進行分析，對每份標本均設副孔，采用GAPDH為內參基因，以Survivin/GAPDH的比值計算出待測樣品的拷貝數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，生存曲線用Kaplan-Meier法建立，與生存時間的關系用Log-rank檢驗。用Cox比例風險模型評估影響預后生存的各變量。采用雙側檢驗進行處理，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Survivin mRNA檢測結果

正常對照組(胃炎患者)外周血中未檢測到Survivin mRNA表達。胃癌組患者Survivin表達檢測率為86%(43例)。其中28例轉移患者的陽性率為100%，22例未轉移的為68.2%(P<0.05)。

2.2 胃癌患者Survivin表達與臨床病理因素之間關系

與未轉移者相比較，有臟器轉移者Survivin mRNA表達明顯增高。Survivin mRNA表達與年齡、性別及淋巴結轉移均無相關性(P>0.05，表1)。

表1 Survivin表達與胃癌臨床病理學因素之間的關系Tab.1 The relationship between Survivin expression level and clinicopathologic features

2.3 預后因素分析

運用COX回歸模型對可能影響胃癌患者預后的各種因素，包括年齡、性別、淋巴結轉移、Survivin表達及病理分期等進行回歸分析。分析結果顯示：病理分期、Survivin mRNA的表達水平是影響胃癌預后的獨立預測因素(表2)。

表2 COX模型篩選的胃癌危險因素及其參數(shù)Tab.2 Multivariate analysis of prognostic factors by COX model

3 討 論

Survivin基因定位于染色體17q25，是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptotic protein，IAP)家族中的新成員，IAP家族的所有成員都具有一個共同的特征，即含有一個有1～3個拷貝的包括70個氨基酸殘基的桿狀病毒IAP重復序列(baculovims IAP repeat，BIR)，BIR功能區(qū)是發(fā)揮功能的主要結構，IAP具有顯著的抑制細胞凋亡的效應。體外實驗表明，Survivin可以與效應細胞死亡蛋白酶caspase-3和caspase-7結合，抑制細胞凋亡，并抑制由Fas、Bax、抗癌藥物誘導的細胞凋亡［2］。胃癌是化療相對敏感的腫瘤，多種抗癌藥物治療腫瘤的原理是通過凋亡途徑導致腫瘤細胞死亡，這提示凋亡抑制基因Survivin可作為胃癌患者對于化療是否敏感的指標之一，從而指導腫瘤的個體化治療。Survivin基因在腫瘤研究領域備受關注：Survivin表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，但較少表達于正常成人的終末分化組織。Survivin選擇性地在腫瘤中表達，目前已發(fā)現(xiàn)結腸癌、胃癌、食管癌、非小細胞肺癌等腫瘤中有Survivin的表達［3-6］。有研究表明Survivin在胃癌組織中100%表達。而在胃癌周圍正常組織中幾乎不表達［7］。但姚學權等［8］利用免疫組化SP法檢測Survivin在胃腺癌中的表達，結果顯示：胃癌原發(fā)灶、淋巴結轉移癌細胞及正常腺體基底生發(fā)層細胞的Survivin的陽性表達率分別為49.2%、64.0%和17.5%。

目前國內檢測Survivin常采用的是腫瘤組織及免疫組化的方法，而要對胃癌不同治療階段進行監(jiān)測，了解化療時藥物對腫瘤細胞誘導凋亡作用，僅僅檢測胃癌組織中Survivin的表達是不夠的，需要采用新的途徑和更好的檢測方法。尋找敏感和特異的無創(chuàng)性方法監(jiān)測胃癌是當前的研究熱點，外周血作為腫瘤細胞轉移的載體，是血行轉移的必要條件；實時熒光定量RT-PCR技術可以較準確地檢測腫瘤患者外周血中腫瘤細胞的存在水平。

本研究顯示，正常對照組外周血未檢測到Survivin mRNA的表達。我們認為可能是由于患者外周血中腫瘤細胞的數(shù)量不足以促使Survivin表達，就被機體正常的免疫系統(tǒng)所抑制或消滅。而我們發(fā)現(xiàn)所有有遠處轉移的胃癌患者Survivin均表達，能更好說明Survivin對抑制癌細胞凋亡的作用；在胃癌組患者中Survivin表達檢測率為86.0%，而那些早期或局部晚期的胃癌患者Survivin的表達率為68.2%，較Bertazza等［4］報道的98.6%低；兩者相比，有遠處轉移胃癌患者的Survivin表達率明顯增高(P<0.05)。我們還對Survivin mRNA表達與年齡、性別及淋巴結轉移相關性作了研究，結果發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA表達與這些臨床病理特征均無相關性(P>0.05)。以上結果表明隨著腫瘤病期的增加，Survivin表達水平升高，提示Survivin的表達在腫瘤的侵襲和血行轉移過程中起一定作用。本研究結果與Song等［9］的研究結果基本相似，僅腫塊大小的臨床病理特征與Survivin 表達有關，而與年齡、性別、淋巴結轉移無相關性；但與Yie等［10］報道的浸潤深度、淋巴結轉移狀態(tài)及疾病分期與Survivin mRNA表達有關的研究結果不同。我們認為這也可能是由于彼此所使用的檢測方法及入組的個體差異有關。

COX回歸模型對可能影響胃癌患者預后的因素進行回歸分析，結果發(fā)現(xiàn)：腫瘤分期、Survivin mRNA的表達水平是影響胃癌預后的獨立因素，表明Survivin對胃癌的發(fā)生、發(fā)展影響顯著，且外周血Survivin的檢測可作為臨床評估胃癌患者預后的客觀指標。

總之，實時熒光定量RT-PCR技術檢測腫瘤患者外周血中腫瘤細胞的水平是一種敏感而又特異的無創(chuàng)傷方法。Survivin作為新的凋亡抑制蛋白，對胃癌的發(fā)生、發(fā)展的影響重大。采用實時熒光定量RT-PCR法檢測胃癌外周血中Survivin mRNA表達水平，對胃癌復發(fā)、轉移的檢測和預后判斷具有一定價值。

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