周慶氫， 張 聰， 謝 松

(1.上海雷允上藥業(yè)有限公司，200002;2.上海市中藥研究所，201401)

蟾烏巴布膏是劉嘉湘教授的臨床驗(yàn)方，由蟾蜍、川烏、重樓等24味名貴藥材組成，應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)，采用親水性高分子輔料制備的巴布膏。蟾烏巴布膏對(duì)腫瘤以及其他疼痛均有良好的療效，更有活血化瘀，消腫止痛之功效，被臨床廣泛認(rèn)可，是國(guó)內(nèi)唯一腫瘤中藥外用藥。為控制該制劑質(zhì)量，采用色譜法對(duì)其中的蟾酥、生川烏、生關(guān)白附、兩面針、蓽茇、細(xì)辛、乳香、沒(méi)藥、丁香、肉桂等藥材進(jìn)行了鑒別，并采用氣相譜法對(duì)蟾烏巴布膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯等多個(gè)有效成分的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP-6890 plus氣相色譜儀(美國(guó)HP公司)，氫火焰檢測(cè)器，HS3120型超聲波提取儀(淮陰漢邦科技有限公司)，梅特勒托利多AE240電子天平(十萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥 丁香酚、桂皮醛、胡椒堿、樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對(duì)照品，兩面針、蓽茇、細(xì)辛、乳香、沒(méi)藥對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，石油醚(60～90℃)為分析純(杭州煉油廠)，其余試劑均為分析純(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，硅膠G、硅膠H、硅膠GF254薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠)。

1.3 樣品 蟾烏巴布膏(上海雷允上藥業(yè)有限公司)，批號(hào):071001，071101，071201。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜鑒別

2.1.1 蟾酥的薄層鑒別［1］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為供試品溶液。

另取脂蟾毒配基及華蟾酥毒基對(duì)照品，加氯仿制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)［2］，吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各5 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮(4∶3∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 蟾酥薄層鑒別色譜圖

2.1.2 生川烏、生關(guān)白附的薄層鑒別［3］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

取生川烏、生關(guān)白附對(duì)照藥材1 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿 50 mL，加熱回流 1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

另取烏頭堿對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液15μL，及對(duì)照藥材、對(duì)照品溶液各10μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二乙胺(8∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.3 兩面針的薄層鑒別［4］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為供試品溶液。

另取兩面針對(duì)照藥材1 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液5μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(20∶5∶3∶1∶0.12)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.1.4 蓽茇的薄層鑒別［5］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為供試品溶液。

取蓽茇對(duì)照藥材0.5 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取胡椒堿對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部 附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μL，對(duì)照藥材1μL和對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇(v/v)溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。

圖2 蓽茇的薄層鑒別色譜圖

2.1.5 細(xì)辛的薄層鑒別［6］取本品1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。

另取細(xì)辛對(duì)照藥材1 g，加乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μL和對(duì)照藥材溶液3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(85∶15)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。(見(jiàn)圖3)

圖3 細(xì)辛的薄層鑒別色譜圖

2.1.6 乳香、沒(méi)藥的薄層鑒別［7］取本品1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。

取乳香、沒(méi)藥對(duì)照藥材各0.5 g，各加乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)謩e加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，取供試液溶液10μL，對(duì)照藥材溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(85∶15)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。(見(jiàn)圖4)

圖4 乳香、沒(méi)藥的薄層鑒別色譜圖

2.1.7 丁香、肉桂的鑒別 取本品2片，剪成小塊，除去蓋襯，置250 mL回流瓶中，加乙酸乙酯100 mL，水浴上回流1 h，迅速冷卻，用鋪有無(wú)水硫酸鈉的漏斗濾過(guò)，濾液減壓回收至干，殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，離心，取上清液，作為供試品溶液。

另取丁香酚和桂皮醛對(duì)照品，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含丁香酚0.15 mg、桂皮醛0.015 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照氣相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI E)試驗(yàn)，用彈性石英毛細(xì)管柱，以聚乙二醇PEG-20M為固定相，柱溫為180℃。分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1μL，注入氣相色譜儀。供試品溶液色譜圖中應(yīng)呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰。

2.2 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量測(cè)定［8］

2.2.1 試液的配制 內(nèi)標(biāo)溶液的制備:取萘適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇溶解，制成每1 mL含1.2 mg的溶液，即得。

混合標(biāo)準(zhǔn)品的制備:取樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯對(duì)照品適量，分別精密稱定，分別加無(wú)水乙醇制成每1 mL含1、2、1、1 mg的溶液。分別精密量取上述4種對(duì)照品溶液1 mL，置同一20 mL量瓶中，精密加入上述內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備:取蟾烏巴布膏5片，每片分別精密截取6 cm2，共30 cm2，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，精密加入無(wú)水乙醇50 mL，稱定重量，置水浴上回流2 h，迅速用冰浴冷卻，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，置20 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) J＆W INNOWAY彈性石英毛細(xì)管柱(固定相為聚乙二醇PEG-20 m，30 m ×0.53 mm，固定相厚度 1 μm)，程序升溫，柱溫140℃保持23 min，以每分鐘6℃升溫至200℃保持20 min，進(jìn)樣溫度280℃;檢測(cè)器溫度300℃，分流進(jìn)樣，分流比1∶1，理論板數(shù)以薄荷腦計(jì)算不低于20 000。

分別取樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯空白樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)，空白樣品均無(wú)干擾，且供試品在內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間處無(wú)干擾。見(jiàn)圖5～7。

圖5 供試品中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量測(cè)定氣相色譜圖

圖6 基質(zhì)空白溶液氣相色譜圖

圖7 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對(duì)照品溶液氣相色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品貯備液按一定稀釋比例，配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，分別吸取1μL注入氣相色譜儀，測(cè)得各組份及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，并計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯等線性關(guān)系考察

表明:在線性范圍內(nèi)樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯線性關(guān)系良好。

2.2.4 日間精密度 取線性關(guān)系試驗(yàn)中取同一供試品溶液在不同日分別進(jìn)樣5次，每次1μL，在以下時(shí)間點(diǎn):0、1、2、3、5 d 時(shí)測(cè)定色譜峰吸收值，結(jié)果樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的 RSD分別為0.88% 、1.65% 、1.42% 、1.11% 。

2.2.5 日內(nèi)精密度 取線性關(guān)系試驗(yàn)中同一供試品溶液在當(dāng)日分別進(jìn)樣5次，每次1μL，在以下時(shí)間點(diǎn):0、1、2、4、10 h 時(shí)測(cè)定色譜峰吸收值，結(jié)果樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的 RSD分別為0.32% 、1.00% 、0.29% 、1.49% 。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取蟾烏巴布膏(批號(hào):071001)，分取5份，分別按2.2.1項(xiàng)及2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 日重復(fù)性試驗(yàn)(n=5)

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取蟾烏巴布膏(批號(hào):071101)，分取6份，加入一定量對(duì)照品，按2.2.1項(xiàng)及2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.8 樣品測(cè)定 分別精密吸取3批樣品(071001、071101、071201)的供試品溶液，與混合對(duì)照品溶液1μL注入氣相色譜儀，進(jìn)樣測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 蟾烏巴布膏是采用親水性高分子輔料制備的巴布膏，為保證產(chǎn)品質(zhì)量我們對(duì)該產(chǎn)品中的多味藥材進(jìn)行了定性的研究，采用薄層色譜法對(duì)其中的蟾酥、生川烏、生關(guān)白附、兩面針、蓽茇、細(xì)辛、乳香、沒(méi)藥、丁香、肉桂等藥材進(jìn)行了鑒別，建立蟾烏巴布膏中蟾酥、兩面針、蓽茇、細(xì)辛、乳香、沒(méi)藥、丁香、肉桂的定性方法，其中生川烏和生關(guān)白附的鑒別，因?yàn)榇嬖诟蓴_，故需要進(jìn)一步研究。

表4 樣品的含量測(cè)定

3.2 本試驗(yàn)比較了以不同溶劑(甲醇、無(wú)水乙醇)、不同提取方法(超聲、回流、索氏提取)和不同超聲時(shí)間(15、30、45、60 min)對(duì)樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯提取效果的影響。結(jié)果以無(wú)水乙醇回流提取的效率最高，回流時(shí)間2 h，已可將樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯提取完全，故選用無(wú)水乙醇回流提取2 h作為提取條件。

3.3 通過(guò)實(shí)驗(yàn)，制定了蟾烏巴布膏中蟾酥、兩面針、蓽茇、細(xì)辛、乳香、沒(méi)藥、丁香、肉桂等八味藥材的色譜鑒別方法，并用氣相色譜法測(cè)定了產(chǎn)品中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量。方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可有效的控制蟾烏巴布膏的質(zhì)量。

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