楊 遜， 陳 鈞*， 韓邦興，2， 趙 磊， 李晨光， 楊 雪

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013;2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安237012;3.江蘇工業(yè)學(xué)院信息科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇常州213164)

水飛薊素(silymarin)系指從菊科植物水飛薊(Silybum marianum L.Gaertn)的種子中提取的一類黃酮木脂素類成分，主要存在于種皮中［1］，具有抗自由基、保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用［2］，對(duì)大腦的氧化應(yīng)激［3］及燙傷引起的氧化性皮膚損傷［4］具有保護(hù)作用。水飛薊素難溶于水，因此提高其生物利用度具有重要的臨床意義［5］。為了提高生物利用度，目前水飛薊素的制劑有固體分散體、脂質(zhì)體、磷脂復(fù)合物、羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、滴丸等［6］。

固體分散技術(shù)是一種能夠提高難溶性物質(zhì)溶出速率的制劑技術(shù)，其制備方法簡(jiǎn)單，但未見水飛薊素固體分散體的藥效學(xué)研究。本試驗(yàn)旨在將從水飛薊種皮中提取的水飛薊素制備成固體分散體，通過指標(biāo)的測(cè)定，考察其對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，并與市售的普通片劑進(jìn)行比較。通過Hism函數(shù)，考察各組與空白組間的相似系數(shù)，從整體上考察各組間的差異。

1 儀器、試劑與動(dòng)物

HH66MC超聲機(jī)，無錫超電子設(shè)備廠;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;Z-1智能溶出度儀，天津大學(xué)儀器廠;THZ-C恒溫振蕩儀，江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠;spectral90型酶標(biāo)儀，美國(guó)MD分子儀器公司。

乙酸乙酯、無水乙醇、PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮)，鹽酸(濃度為36.5%)、羥甲基纖維素鈉(CMCNa)，CCl4，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水飛薊賓對(duì)照品(批號(hào)0856－200203)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;ALT、AST、SOD、MDA測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;益肝靈(批號(hào):080302，每片重0.18 g，含水飛薊賓38.5 mg)，江蘇中興藥業(yè)有限公司。

pH值為1.2的人工胃液:取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1 000 mL即得;水飛薊種皮:由江蘇中興藥業(yè)有限公司提供。

ICR小鼠，♀♂各半，體重為18～22 g，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)為SCXR(蘇)-2007-0001。試驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用紫外分光光度法，測(cè)定水飛薊素的含量。紫外光譜掃描顯示，PVP的加入不影響水飛薊素的最大吸收波長(zhǎng)(287 nm)。精密稱取105℃干燥至恒重的水飛薊賓對(duì)照品6.4 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密移取0.25、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 量瓶中，分別加水、人工胃液定容至刻度。以A表示吸光度，C表示濃度mg/mL，以水為背景的回歸方程為A=43.821C+0.018 5，R2=0.998 6;以人工胃液為背景的回歸方程為 A=48.651C+0.026 4，R2=0.998 6。

2.2 水飛薊素固體分散體的制備

采用熱回流提取法，以6倍量乙酸乙酯于80℃水浴鍋中連續(xù)提取水飛薊種皮8 h，回收溶劑、烘干、石油醚洗滌，得提取物，UV法測(cè)得提取物中水飛薊素的含量為82.15%，HPLC法測(cè)得水飛薊賓的含量為36.97%。根據(jù)溶劑法［7］制備固體分散體，按照1∶1、1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1∶11 準(zhǔn)確稱取水飛薊素與PVP，用適量的無水乙醇，超聲溶解，在60℃水浴上揮去溶劑，于60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，取出后粉碎過60目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溶解度試驗(yàn)

稱取0.5 g水飛薊素及不同比例的水飛薊素-PVP固體分散體，各加入5 mL蒸餾水中，使其呈過飽和狀態(tài)，置37℃恒溫空氣振蕩器中，120 r/min振搖24 h，以4 000 r/min速度離心15 min，取上清液，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，于287 nm處測(cè)定其紫外吸光度，求其溶解度。

2.4 體外溶出度試驗(yàn)

試驗(yàn)方法按照《中華人民共和國(guó)藥典》(05版)［8］二部“附錄 XC”規(guī)定，采用第二法(槳法)測(cè)定自制水飛薊素及其固體分散體的體外溶出度。以900 mL脫氣后的人工胃液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速(100±1)r/min，水浴溫度為37℃。分別取水飛薊素及其固體分散體(含水飛薊素80 mg)粉末均勻撒入介質(zhì)中，分別于5、10、20、30、45、60、120 min 取樣，每次 5 mL，并補(bǔ)充等體積的釋放介質(zhì)，取樣液用0.45μm的微孔濾膜過濾后，于287 nm處測(cè)定其紫外吸光度，求其體外累積溶出率%。

2.5 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立及動(dòng)物試驗(yàn)

ICR小鼠60只，體重為(20±2)g，每組10只，♀♂各半，隨機(jī)分為空白組(正常飼養(yǎng)，不做任何處理)、模型組(造模不給藥)、益肝靈低劑量及高劑量組(益低組、益高組)、水飛薊素固體分散體低劑量及高劑量組(固低組、固高組)，共6組。

益肝靈說明書可知，成人用量為每日231 mg水飛薊賓，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中劑量的換算［9］，并按照不同給藥劑量的動(dòng)物試驗(yàn)中片劑與固體分散體水飛薊賓的給藥量各自相等的原則，確定試驗(yàn)小鼠水飛薊賓的灌胃量:低劑量組為30 mg/kg，高劑量組為120 mg/kg。用0.5%的CMC-Na分別溶解益肝靈及固體分散體，配制好相應(yīng)的濃度后，各組按10 mL/kg灌胃給藥，空白組和模型組灌服相應(yīng)劑量的0.5%CMC-Na，每日1次，連續(xù)6 d，第6天灌胃后2 h后，除空白組，每組小鼠按10 mL/kg注射含0.1%CCl4的大豆色拉油溶液，同時(shí)禁食不禁水。

2.6 指標(biāo)的測(cè)定

造模20 h后，小鼠眼眶取血，分離血清，測(cè)定ALT及AST活力。小鼠處死后，取小鼠肝稱重并計(jì)算肝系數(shù)(肝臟濕重與體重之比)。同時(shí)，制備10%的肝勻漿，測(cè)定肝勻漿MDA及SOD。以上指標(biāo)均按試劑盒操作說明測(cè)定。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 水飛薊素固體分散體的溶解及溶出特性研究

3.1.1 溶解度試驗(yàn)結(jié)果

水飛薊素在水中的溶解度為0.145 mg/mL。由圖1可知，隨著水飛薊素固體分散體中PVP的增加，水飛薊素在水中的溶解度逐漸增加。當(dāng)比例為1∶5、1∶7、1∶9、1 ∶11 時(shí)，固體分散體的溶解度分別是水飛薊素溶解度的36、62、64和90倍，由此可見，輔料PVP顯著增加水飛薊素在水中的溶解度。

圖1 水飛薊素-PVP固體分散體在水中的溶解度

3.1.2 體外溶出度試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)無PVP加入時(shí)，水飛薊素在介質(zhì)的溶出速率和溶出度都較低，120 min過后只有20%左右。載體PVP的加入，使溶出的速率和程度都有不同程度的提高，但1∶7與1∶9的固體分散體體外溶出度相差不大。而當(dāng)水飛薊素與PVP比例為1∶7時(shí)，溶解度同樣得到顯著提高，為了控制PVP的用量，選擇此比例進(jìn)行小鼠試驗(yàn)。

圖2 水飛薊素-PVP固體分散體的累積溶出曲線

3.2 固體分散體對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

3.2.1 指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

各組小鼠分別進(jìn)行五個(gè)指標(biāo)的測(cè)定，見表1。結(jié)果可知，模型組與空白組均有極顯著差異(P<0.01)，說明造模成功。

肝系數(shù)測(cè)定結(jié)果中，各用藥組與模型組均有顯著性差異(P<0.05)，說明水飛薊素能夠有效的改善CCl4引起的小鼠肝臟腫大;益低組、益高組、固低組的ALT與模型組無明顯差異，其改善指標(biāo)ALT作用不強(qiáng)，但固高組與模型組存在極顯著性差異(P<0.01)，且固高組與益高組之間存在極顯著性差異(P<0.01)，可知固體分散體效果強(qiáng)于片劑益肝靈;除益低組，其它各治療組的AST與模型組均存在顯著差異(P<0.05，P<0.01)，且固體分散體與相應(yīng)劑量的益肝靈相比差異顯著(P<0.05)。

SOD與MDA測(cè)定結(jié)果顯示，治療組不同程度使降低的SOD值升高、使升高的MDA值降低，且固體分散體對(duì)MDA的影響程度明顯高于益肝靈(P<0.05，P<0.01)。

3.2.2 各組與空白組間的綜合分析

表1 固體分散體對(duì)小鼠肝系數(shù)、ALT、AST、SOD、MDA的影響(±s)

表1 固體分散體對(duì)小鼠肝系數(shù)、ALT、AST、SOD、MDA的影響(±s)

注:與空白組相比，☆☆P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01;與相應(yīng)劑量的陽(yáng)性對(duì)照藥益肝靈相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 水飛薊賓劑量/(mg/kg)肝系數(shù)/%ALT/(U/L)AST/(U/L)SOD/(U/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)空白組 — 4.85±0.06 27.10±2.26 58.57±4.84 149.41±3.01 3.47±0.45模型組 — 6.18±0.09☆☆ 124.65±3.85☆☆ 174.22±6.61☆☆ 82.73±3.46☆☆ 6.09±0.21☆☆益低組 30 5.37±0.08△ 111.93±9.30 154.4±12.64 97.57±4.45△△ 4.51±0.43△△益高組 120 5.20±0.11△ 102.37±4.97 149.06±6.98△ 103.19±1.32△△ 3.64±0.26△△固低組 30 5.22±0.05△ 103.25±15.1 128.10±7.25△△▲ 113.53±6.11△△ 3.80±0.39△△▲固高組 120 4.98±0.12△ 50.89±14.03△△▲▲ 70.46±10.50△△▲ 143.59±7.14△△ 3.08±0.18△△▲▲

由以上5個(gè)指標(biāo)的測(cè)定可知，治療組對(duì)各指標(biāo)均有改善作用，但各個(gè)治療組對(duì)不同指標(biāo)的影響程度不相同，為了充分比較固體分散體與片劑益肝靈之間的差異，進(jìn)一步從整體上進(jìn)行分析。

設(shè) X=(x1，…，xd)和 Y=(y1，…，yd)是 d 維空間中的兩個(gè)點(diǎn)，相似性度量函數(shù)如下［10］:

取表1中各個(gè)指標(biāo)的平均值構(gòu)成6×5的矩陣，將每?jī)山M5個(gè)指標(biāo)的數(shù)值分別代入Hism函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，求出組間相似系數(shù)。試驗(yàn)中，d(d=5)為指標(biāo)個(gè)數(shù)，xi、yi為所比較的兩組(X與Y)中第i個(gè)指標(biāo)的平均值。Hism函數(shù)描述多維空間中兩點(diǎn)的接近程度，當(dāng)兩點(diǎn)完全重合時(shí)，函數(shù)值為1;當(dāng)兩點(diǎn)無限遠(yuǎn)離時(shí)，函數(shù)值為0。當(dāng)以空白組為比較基準(zhǔn)時(shí)，該函數(shù)值越大，表示被比較組的數(shù)據(jù)總體上越接近空白組，即治療效果越好。

由表2可知，各試驗(yàn)組與空白組之間的相似系數(shù)由大到小依次是:固高組，益高組，固低組，益低組，模型組，其中固高組與空白組最接近，說明固體分散體的效果明顯優(yōu)于片劑，且一定范圍內(nèi)的高劑量?jī)?yōu)于低劑量。

表中固高組和益高組與空白組之間的相似系數(shù)之差為0.043 2，而固低組與益低組與空白組之間的相似系數(shù)之差為0.070 7，說明低劑量時(shí)改變藥物的劑型，對(duì)于藥效的提高更有效。

表2 各組與空白組之間的Hism函數(shù)相似系數(shù)

4 討論

固體分散體是一種難溶性藥物以分子、膠態(tài)、微晶或無定形態(tài)，分散于另一種水溶性材料中的技術(shù)，本文通過對(duì)不同比例水飛薊素-PVP固體分散體的溶解度及體外溶出度的考察，說明PVP為一種提高水飛薊素溶解度與溶出度的良好載體。從經(jīng)濟(jì)與實(shí)用的角度出發(fā)，最終選擇以水飛薊素與載體PVP比例為1∶7的固體分散體，作為小鼠急性肝損傷試驗(yàn)中的供試藥。

CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基可與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使酶的功能喪失，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，胞漿Ca2+濃度升高，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液。試驗(yàn)中，利用CCl4致肝損傷模型中指標(biāo)的測(cè)定，證明給藥組對(duì)各指標(biāo)都有不同程度的改善作用，固體分散體對(duì)一些指標(biāo)的效果明顯優(yōu)于片劑。這與以往水飛薊素對(duì)于脂質(zhì)過氧化作用的對(duì)抗作用相一致，且本文將藥劑學(xué)的藥物體外理化性質(zhì)的改變應(yīng)用于藥效研究，體內(nèi)外的結(jié)合更加說明提高溶解度和體外溶出度對(duì)于治療效果的影響不容忽視，這可能與藥物的生物利用度得到提高有關(guān)。

Hism函數(shù)是一種新的高維數(shù)據(jù)距離函數(shù)或相似度量函數(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)在于在該函數(shù)中占主導(dǎo)地位的是那些X和Y在其上差別較小(非常靠近)的維。只要在某些維上X和Y的數(shù)值比較接近，就會(huì)表現(xiàn)出一定的相似性［10］。為了綜合五個(gè)指標(biāo)同時(shí)考慮制劑對(duì)小鼠的影響作用，本文首次利用此函數(shù)對(duì)試驗(yàn)所得各組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到各組與空白組之間的相似系數(shù)，這與預(yù)期效果相吻合。結(jié)合多個(gè)指標(biāo)，用此法判斷藥物對(duì)癥狀的總體影響較為全面、具體和直觀。

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