劉新霞， 趙燕燕， 陳春生， 白 潔

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;3.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定071000)

高良姜(Alpinia officinarum Hance)為姜科山姜 屬植物高良姜的干燥根莖，歷版《中國(guó)藥典》均有收載，主產(chǎn)于福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、云南等地，產(chǎn)量豐富［1］。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)其不同提取物在改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙方面進(jìn)行研究，并進(jìn)行比較，為中藥高良姜防治血管性癡呆癥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

高良姜不同提取物(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供);尼莫地平(天津市中央藥業(yè)有限公司070506);亞硝酸鈉(北京雙環(huán)試劑廠20070406);超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

小鼠Morris水迷宮裝置及跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟公司產(chǎn));X-15R低溫離心機(jī)(美國(guó)貝克曼有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠90只，體重18～22 g，♀♂各半，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):DK0704-128。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞硝酸鈉致小鼠記憶鞏固障礙模型的復(fù)制及小鼠 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［2，3］

取昆明種小鼠90只，18～22 g，♀♂各半，按體重隨機(jī)分為9組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、尼莫地平(30 mg/kg)組、高良姜水提取物6.66、3.33、1.67 mg/kg組、高良姜乙醇提取物6.66、3.33、1.67 mg/kg組(均按生藥量計(jì))，每組10只。分別灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組分別給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)13 d。喂藥第10天開(kāi)始，按文獻(xiàn)方法進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 d，每天測(cè)試1次(每次包括2個(gè)入水點(diǎn))。測(cè)試時(shí)，隨機(jī)選擇無(wú)平臺(tái)象限的入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，讓其自由尋找平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留20 s，記錄其逃避潛伏期。如果小鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)，逃避潛伏期記為90 s。每天取每只小鼠2次逃避潛伏期的平均值作為其一天的學(xué)習(xí)成績(jī)。每天訓(xùn)練結(jié)束后，除空白對(duì)照組給予生理鹽水外，其余各組小鼠均立即腹腔注射亞硝酸鈉120 mg/kg。

1.3.2 小鼠腦組織中SOD活力及MDA含量的測(cè)定［4］

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，斷頭取大腦，用預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙拭干，取一半腦組織，以重量/體積比1∶9加入4℃生理鹽水，制成10%的勻漿，4 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明，用可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)測(cè)定大腦組織SOD活性及MDA含量。

1.3.3 小鼠腦組織石蠟切片的制備及HE染色［5］

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，斷頭取大腦，用預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙擦拭干，取一半腦組織，HE染色，顯微鏡下觀察海馬形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠Morris水迷宮定向游泳實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響

結(jié)果表明，高良姜水提取物及乙醇提取物均能顯著縮短亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期，高良姜水提取物比乙醇提取物的作用強(qiáng)，且水提取物給藥劑量為3.33 mg/kg效果最好，見(jiàn)表1。

表1 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠M orris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響(±s，n=10)

表1 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠M orris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，#P<0.05，###P<0.001;與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

組別 劑量/(mg/kg)潛伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天空白對(duì)照組 — 86.38±7.56 65.13±20.11 49.83±27.50 45.63±17.31模型對(duì)照組 — 88.21±4.72 85±10.31# 78.41±11.73# 83.42±11.51###尼莫地平組 30 90.00±0.00 71.5±20.27 47.40±24.15* 67.5±22.89高良姜水提取物 6.66 83.41±13.40 68.17±23.37 51.9±30.72 53.9±31.91*3.33 64.58±20.99* 62.91±25.53 21.5±10.67*** 30.17±12.89***1.67 79.21±13.61 78.07±15.58 44.00±25.59* 48.07±23.06**高良姜乙醇提取物 6.66 81.38±11.59 44.37±19.25** 44.5±16.16** 72.12±18.89 3.33 86.00±8.94 87.80±3.19 64.80±15.98 55.50±10.70**1.67 83.64±13.97 67.00±18.13* 47.21±22.03* 50.50±31.07*

2.2 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠腦組織中SOD活力及MDA含量的影響

結(jié)果表明，高良姜水提取物及乙醇提取物均能顯著降低MDA含量、提高SOD活力，增強(qiáng)小鼠清除自由基的能力，見(jiàn)表2。

表2 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠腦組織SOD活力及 MDA 含量的影響(ˉx ±s，n=10)

2.3 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠海馬組織形態(tài)的影響

高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠海馬組織形態(tài)的影響詳見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積增大、胞漿深染、空泡樣變，神經(jīng)軸突消失，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、胞膜核膜界限不清;高良姜水和乙醇提取物高、中、低劑量組不同程度的改善了亞硝酸鈉模型小鼠腦組織海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)，其改善程度與劑量有關(guān)，以低劑量組效果較好。

圖1 高良姜提取物對(duì)記憶鞏固障礙小鼠海馬組織形態(tài)的影響(HE染色，10×40)

3 討論

隨著老齡人口的日益增多及生活水平的提高，血管性癡呆的發(fā)病率逐年升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高良姜水提取物及乙醇提取物均能顯著延長(zhǎng)亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期，高良姜水提取物比乙醇提取物的作用強(qiáng)，且水提取物3.33 mg/kg劑量組效果最好。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組小鼠腦組織中SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高;高良姜水提取物及乙醇提取物均能顯著降低MDA含量、提高SOD活力，增強(qiáng)小鼠清除自由基的能力，提高亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，乙醇提取物1.67 mg/kg劑量組效果最顯著。

海馬結(jié)構(gòu)是學(xué)習(xí)記憶的重要部位，其中，海馬區(qū)對(duì)缺氧缺血特別敏感，海馬區(qū)被認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［6］。

本研究結(jié)果表明，高良姜水提取物及乙醇提取物均能顯著改善記憶鞏固障礙小鼠的海馬組織學(xué)改變。

綜上所述，高良姜水提取物及乙醇提取物均能提高亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有望成為有效防治血管性癡呆的藥物。其作用機(jī)制可能與提高機(jī)體自由基清除能力，降低自由基水平有關(guān)。

［1］呂 瑋，蔣伶活.高良姜的化學(xué)成分及藥理作用［J］.中國(guó)藥業(yè)，2006，15(3):19-20.

［2］Raineteau O，Rietschin L，Gradwohl G，et al.Neurogenesis in hippocampal slice cultures［J］.Mol Cell Neurosci，2004，26(2):241-250.

［3］喻 欣，郭蓮軍，艾永循，等.氯化銫對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(4):488-492.

［4］李 強(qiáng)，胡長(zhǎng)林，王景周.地黃益知浸膏對(duì)老年性癡呆大鼠行為學(xué)及中樞膽堿能系統(tǒng)的影響［J］.中成藥，2008，30(1):38-42.

［5］余麗梅，于 爽，龔其海，等.夏天無(wú)注射液對(duì)血管性癡呆大鼠海馬血管生成素-1表達(dá)的影響［J］.中成藥，2006，28(6):839-842.

［6］Cold P E.Acetylclholine modulation of neural:systems involved in learning and memory［J］.Neurobiol，2003，80(3):194-210.