胡占嵩， 喬 衛(wèi)， 李 陸， 劉婧姝， 符敬偉

(天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070)

1 引言

抑郁癥是一類嚴重危害人類身心健康的精神疾病，其終生患病率為6.1%～9.5%，嚴重的抑郁癥患者中有15%的患者因自殺而結(jié)束生命。目前臨床使用的抗抑郁藥物長期使用副作用較大、療效降低，尚不能令人滿意。因此國內(nèi)外抗抑郁藥的研制和開發(fā)方面越來越注重傳統(tǒng)中藥與中藥復(fù)方［1］。本市安定醫(yī)院以酸棗仁和合歡皮配伍的復(fù)方制劑進行抗抑郁治療，臨床療效顯著，有效率可達90%。我們在總結(jié)前人方劑的基礎(chǔ)上，確定以酸棗仁、合歡皮、白芍和柏子仁四味中藥組成酸棗仁合歡方［2］，研究其抗抑郁作用，并對其制備工藝進行初步篩選。旨在研制一種高效、低毒的抗抑郁中藥復(fù)方，為開發(fā)成為抗抑郁新藥打下前期工作基礎(chǔ)。

2 材料及試藥

2.1 儀器

BP211D十萬分之一分析天平(上海君達儀器廠);R204型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);秒表(瑞士霍耶爾-奧利達斯廠);MC-3數(shù)字式溫度體溫計(奧姆龍(中國)有限公司)。

2.2 試劑

95%乙醇分析純;X-5大孔吸附樹脂，南開大學(xué)化工廠;AB-8大孔吸附樹脂，購于天津市海光華工有限公司 均為精品級。

2.3 實驗動物

♂性ICR小鼠80只，清潔級，體重(20±2)g購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，合格證號:SCXK津2005-0001。實驗前在實驗室飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境。室溫(22±2)℃，相對濕度65% ～70%。光照12 h，自由飲食、攝水。

2.4 藥品

酸棗仁(Semen Ziziphi spinosae)、合歡皮(Cortex Albiziae)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、柏子仁(Semen Platycladi)均購于天津太平大藥房，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)生藥教研室鑒定;鹽酸氯米帕明片(北京諾華制藥有限公司，批號:X0010，25 mg/片);利血平注射液(廣東邦民制藥廠有限公司，批號:061220，1 mL ∶1 mg)。

3 實驗方法

3.1 酸棗仁合歡方的不同制備工藝

酸棗仁合歡方由酸棗仁、合歡皮、白芍、柏子仁4種中藥按4∶2∶3∶2的配比制成，本實驗以傳統(tǒng)中藥提取方法為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代中藥提取技術(shù)，共設(shè)計以下4種不同制備工藝。

3.1.1 制備工藝1(水提法):將4味藥材用水煎煮2次(10，2 h;8，1 h)，合并煎液，減壓濃縮，備用。

3.1.2 制備工藝2(醇提法):將4味藥材用70%乙醇回流提取2次(10，2 h;8，1 h)，合并濾液，減壓濃縮至浸膏，備用。

3.1.3 制備工藝3(醇提法結(jié)合X-5大孔吸附樹脂):將制備工藝2所得浸膏以蒸餾水溶解，過X-5大孔吸附樹脂，分別用2倍量蒸餾水，3倍量70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液，濃縮蒸干，備用［3］。

3.1.4 制備工藝4(醇提法結(jié)合AB-8大孔吸附樹脂):將制備工藝2所得浸膏以蒸餾水溶解，過AB-8大孔吸附樹脂，分別用2倍量蒸餾水，3倍量70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液，濃縮蒸干，備用。

3.2 酸棗仁合歡方抗抑郁藥效學(xué)評價［4-5］

3.2.1 實驗動物給藥方案:將上述4種制備工藝所得供試品均按原藥材折算后給藥，實驗動物分組及給藥見表1。于每日上午9:00～10:00灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d后進行測試。

表1 實驗動物分組及給藥方案

3.2.2 小鼠懸尾實驗:將小鼠尾部1～2 cm處的部分貼在一水平木棍上，使動物成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺面約20 cm，懸掛兩側(cè)用板隔開動物視線。觀察6 min，并記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間為失望時間。

3.2.3 小鼠強迫游泳實驗:給藥方案同上，末次給藥后1 h進行實驗。實驗前小鼠訓(xùn)練游泳6 min，24 h后測試:將小鼠放入水深10 cm的玻璃缸內(nèi)(高20 cm，直徑14 cm)，水溫(25±2)℃。觀察6 min，記錄比較各組后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。動物不動行為的評判標準是小鼠微卷軀體，但保持垂直姿勢，鼻孔露出水面。

3.2.4 空場實驗:空場實驗由一個圓形的基座組成(直徑80 cm，高20 cm)，基座底部半徑14，28，42 cm處有3個同心圓，并被分為42個單位，不以墻壁隔開。將小鼠單獨放入圓心區(qū)域使其自由探索。記錄其3 min中內(nèi)穿越，站立和修飾的次數(shù)。每只小鼠實驗后應(yīng)用清潔劑將裝置清潔干凈。每只小鼠只進行一次實驗。

3.2.5 拮抗利血平誘發(fā)的小鼠體溫降低實驗:動物分組及給藥方案同上。體溫測定采用數(shù)字式電子體溫計。事先用少許硅油涂擦電子體溫計，使之潤滑，將體溫計探頭輕輕插入小鼠肛門1～2 cm，當(dāng)溫度顯示穩(wěn)定后記錄讀數(shù)，作為基礎(chǔ)體溫。之后灌胃給予相應(yīng)藥物，1 h后腹腔注射利血平2.5 mg/kg，于注射后1，4及24 h測定體溫，以體溫降低值(ΔT=T基礎(chǔ)－T)作為指標，進行統(tǒng)計分析。

4 結(jié)果

4.1 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠懸尾不動時間的影響

各組小鼠懸尾不動時間與空白對照組比較結(jié)果見表2。結(jié)果表明，醇提高劑量組，X-5組和AB-8組均能顯著縮短小鼠不動時間，顯示出抗抑郁作用。其余組則未表現(xiàn)出抗抑郁作用。

4.2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對強迫游泳小鼠不動時間的影響

各組小鼠游泳不動時間與空白對照組比較結(jié)果，見表2。從表中可以看出，水提組和AB-8組與空白對照組比較均能顯著縮短強迫游泳小鼠的不動時間，與陽性對照組比較在給藥后無顯著性差異(P>0.05)。其他組雖能不同程度地縮短強迫游泳小鼠不動時間，但并無顯著性差異。

表2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠TST與FST實驗不動時間的影響(n=10;±s)

表2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠TST與FST實驗不動時間的影響(n=10;±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

編號 組別 小鼠懸尾實驗累計不動時間/s小鼠強迫游泳實驗累計不動時間/s 1 空白對照組87.60±30.30 131.10±29.03 2 水提組 78.70±40.32 79.50±45.79*3 醇提組低劑量 86.50±31.81 97.90±58.82 4 醇提組中劑量 81.50±41.26 123.20±60.91 5 醇提組高劑量 56.30±26.11* 112.40±33.53 6 X-5組 42.60±24.73** 100.40±67.56 7 AB-8組 50.40±39.89** 77.50±38.63*8 陽性對照組 43.40±23.17** 72.00±55.25*

4.3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響

實驗結(jié)果見表3。通過與空白對照組比較，各個給藥組和陽性對照組在小鼠自主活動，直立和修飾行為上均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可以排除因增強小鼠自主活動而引起的假陽性抗抑郁作用。

表3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響(n=10;±s)

表3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響(n=10;±s)

編號 組別 穿越格數(shù) 直立次數(shù) 修飾次數(shù)1 空白對照組139.80±50.97 11.00±12.53 1.50±0.97 2 水提組 115.40±55.47 8.40±6.80 1.50±1.08 3 醇提組低劑量 139.20±62.79 8.40±6.72 1.10±0.74 4 醇提組中劑量 110.00±61.88 8.00±7.45 1.60±1.27 5 醇提組高劑量 99.80±75.42 7.20±8.57 1.90±2.03 6 X-5組 125.40±44.76 15.70±8.41 1.70±1.42 7 AB-8組 125.60±52.35 10.70±10.07 1.60±1.17 8 陽性對照組126.70±57.89 7.10±7.53 1.00±0.82

4.4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發(fā)小鼠體溫變化的影響

實驗結(jié)果見表4。從表中可以看出，空白對照組腹腔注射利血平4 h體溫明顯下降，且24 h后體溫回升不明顯。X-5組和AB-8組在4 h內(nèi)具有明顯拮抗體溫下降的作用，其中AB-8組在24 h后體溫基本回復(fù)。陽性對照組雖能在一定程度上拮抗體溫下降，但與空白組比較并無顯著性差異，分析可能是AB-8組的拮抗體溫下降作用優(yōu)于陽性對照藥物氯米帕明。

5 討論

5.1 抑郁癥發(fā)病機理較為復(fù)雜，且臨床癥候多樣，這恰與中藥復(fù)方的辨證施治原則相銜接，適合利用傳統(tǒng)中藥復(fù)方治療，便于發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多途徑起效的特點，克服了經(jīng)典抗抑郁藥物單一機制、療效不佳的缺點。

表4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發(fā)小鼠體溫變化的影響(n=10;±s)

表4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發(fā)小鼠體溫變化的影響(n=10;±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

編號 組別體溫變化值(ΔT=T基礎(chǔ) －T)/℃1 h 4 h 24 h 1 空白對照組1.55±1.38 3.46±0.75 2.13±1.89 2 水提組 1.46±1.29 2.99±0.99 1.82±1.53 3 醇提組低劑量 0.32±0.92* 3.08±1.36 1.62±2.59 4 醇提組中劑量 0.94±1.38 3.28±1.39 2.79±1.38 5 醇提組高劑量 2.17±1.76 3.49±0.34 3.22±0.57 6 X-5組 －0.44±1.38**2.64±1.20 1.62±2.13 7 AB-8組 －0.11±1.36**2.14±1.44** 0.80±2.02 8 陽性對照組0.44±0.67 2.90±1.32 2.30±1.62

5.2 本實驗將中藥成方制備工藝與藥效學(xué)實驗相結(jié)合，以動物體內(nèi)藥效指標為指導(dǎo)，篩選中藥成方制備工藝，可保證最佳制備工藝的有效性［6］。藥效學(xué)實驗采用小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗、拮抗利血平所致的體溫降低等抑郁經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ?，反映了動物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態(tài)。實驗結(jié)果顯示，酸棗仁合歡方AB-8組在各實驗中均表現(xiàn)出良好的抗抑郁活性，且無假陽性抗抑郁作用存在，初步認定醇提取法結(jié)合AB-8大孔吸附樹脂提取工藝為酸棗仁合歡方抗抑郁最佳制備工藝。以上結(jié)果為酸棗仁合歡方臨床用于治療抑郁癥打下了前期工作基礎(chǔ)。

5.3 復(fù)方中藥制備工藝的選擇應(yīng)具有一般性，即所設(shè)計的制備工藝應(yīng)是常規(guī)的，具代表性，兼顧不同濃度水平。本研究制備工藝選擇三種方式:其一為中藥傳統(tǒng)湯劑水煎煮工藝;其二為以醇提為主的常規(guī)提取工藝;其三為運用大孔吸附樹脂等現(xiàn)代技術(shù)的提取工藝［6］。根據(jù)本處方中各藥材的有效成分和有效部位多為皂苷和黃酮類化合物，以及我們的前期工作基礎(chǔ)，選取了具有代表性的中等極性AB-8和非極性X-5型大孔吸附樹脂，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

5.4 建立理想抑郁動物模型對探明抑郁癥病因、病理過程，以及研究有效治療藥物極為重要。抑郁癥的發(fā)生，是生化、遺傳、社會環(huán)境之間相互作用的結(jié)果，而目前的各種抑郁癥動物模型，只能表現(xiàn)抑郁癥某一方面的癥狀，各種抑郁模型發(fā)生的病理生理機制各異，對已知的抗抑郁藥作用都有不同程度的選擇性。本實驗中所應(yīng)用的陽性對照藥氯米帕明屬三環(huán)類抗抑郁藥，具有阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺神經(jīng)遞質(zhì)再攝取的作用，從而發(fā)揮抗抑郁作用。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，它使遞質(zhì)留在囊泡外，易被單胺氧化酶降解，從而使單胺類遞質(zhì)(去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺)耗竭。因此該類陽性對照藥在利血平拮抗體溫下降模型中作用較差。由此可見，在抗抑郁藥物的實驗研究中，應(yīng)同時聯(lián)合應(yīng)用幾種抑郁模型，盡可能提高實驗結(jié)果的可信性。

5.5 實踐表明，以酸棗仁和合歡皮配伍的復(fù)方制劑進行抗抑郁治療，臨床有效率可達90%。本研究在總結(jié)前人方劑和臨床實踐的基礎(chǔ)上確立了酸棗仁合歡方。通過以上藥理模型進行的抗抑郁初步實驗驗證，結(jié)果表明，該方抗抑郁療效顯著，效果等同或優(yōu)于陽性對照藥物，我們將繼續(xù)對其有效部位最佳配伍及質(zhì)控方法進行研究，最終開發(fā)成為具有高效、多靶點、低毒、整體調(diào)節(jié)作用的中藥抗抑郁二類新藥，為中藥復(fù)方的二次開發(fā)以及臨床應(yīng)用提供參考。

［1］喬 衛(wèi)，周 晶，段宏泉.治療抑郁癥的中藥組合物及其制備方法:中國，101347524A［P］.2009-1-21.

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