馮自立，馬 娜

無花果蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配行為

馮自立1，馬 娜2

(1.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001； 2.陜西理工學(xué)院物理系，陜西 漢中 723001)

雙水相萃取(ATPS)是近年來發(fā)展起來的新型、廉價酶純化方法。為了擴展該方法應(yīng)用領(lǐng)域，對PEG (polyethylene glycol)/(NH4)2SO4雙水相體系萃取無花果葉中無花果蛋白酶的實驗條件進行研究，考察PEG相對分子質(zhì)量、成相物質(zhì)量分數(shù)、pH值、溫度對無花果蛋白酶在兩相體系中分配系數(shù)(K值)的影響。結(jié)果表明：當兩相體系中PEG相對分子質(zhì)量為1000、PEG質(zhì)量分數(shù)為20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為19%、pH值為6、溫度室溫(25℃)時蛋白酶在兩相體系中分配系數(shù)最高可達3.6。

無花果蛋白酶；雙水相體系；分配系數(shù)K

無花果蛋白酶(Ficin)屬于蛋白水解酶，主要存在于無花果樹樹膠、青果和葉中，是含多種組分的復(fù)合酶，分子質(zhì)量在25000～26000kD左右，等電點(PI)9.0，其中心部位含有必需的巰基，能被半胱氨酸等多種還原劑激活[1]，能以廣泛的專一性水解各種天然蛋白質(zhì)及合成底物的肽鍵、酯鍵和酰胺鍵[2]?？捎糜谑称饭I(yè)的面點改良、肉類軟化、乳制品凝固；Mahajan等[3]研究表明在對油菜餅蛋白改性時，無花果蛋白酶水解所得的肽的起泡性和熱凝膠性均優(yōu)于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，是畜牧業(yè)營養(yǎng)飼料的優(yōu)良改良劑；在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域作為消炎劑、消化促進劑、驅(qū)蟲劑等；同時也是生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的常用試劑。

工業(yè)用酶的大量制備常采用硫酸銨鹽析法、酒精沉淀法和離心噴霧干燥法等，存在分離材料或設(shè)備昂貴、樣品回收率低、樣品處理量小、單一方法分離純化系數(shù)較低等問題，急需尋找樣品處理量大、回收率高、成本低的酶純化方法。雙水相萃取(aqueoustwo-phase extraction，ATPE)提取技術(shù)具有操作條件廉價、易放大、溫和、處理量大、易于連續(xù)操作等優(yōu)點。自從1956 年，瑞典的Albertsson首次運用雙水相萃取技術(shù)提取生物物質(zhì)以來，對于其研究和應(yīng)用逐步展開，并取得了一系列研究成果[4-7]。現(xiàn)在雙水相萃取技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、多肽類抗生素等生物產(chǎn)品的分離和純化以及天然藥用成分提取，并逐步向工業(yè)化生產(chǎn)邁進。本實驗利用PEG(polyethylene glycol)/(NH4)2SO4雙水相體系從無花果葉中萃取分離無花果蛋白酶，考察影響萃取效果的各種因素，對無花果蛋白酶在該體系中的分配行為進行初步研究，為該分離技術(shù)的擴大應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果葉片于2009年5月采自陜西漢中市，－15℃低溫冰箱保存。

PEG(相對分子質(zhì)量為400、600、1000、2000)、硫酸銨、酪蛋白、醋酸鈉、三氯乙酸、稀鹽酸、氫氧化鈉、VC、EDTA-Na、硫代硫酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

質(zhì)量分數(shù)2%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白(天津市化學(xué)試劑廠)2.0g，用0.5mol/mL醋酸鈉在40～50℃水浴加熱條件下溶解。此溶液在冰箱中冷藏保存，有效期為3d。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TB-214電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；精密pH計 上海雷磁儀器廠；SHH421-420型恒溫水浴鍋 河北省黃驊市航天儀器廠；3k30高速離心機德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液提取

將30g冰箱保存的無花果嫩葉剪碎，加入預(yù)冷的pH4.5緩沖液(內(nèi)含0.018g Na2S2O3、VC 0.012g、EDTANa 6mg)50mL，研缽充分研磨出汁，在冰箱中放置2h，抽濾，濾液即為無花果蛋白酶粗酶液。

1.3.2 雙水相體系操作方法

在20mL具塞刻度PV管中加入按實驗安排確定的一定質(zhì)量的PEG、(NH4)2SO4和蒸餾水，使體系總質(zhì)量達20g，溶解混合，形成雙水相體系。所得體系中上相富集PEG，下相為鹽相，然后向其中加入2mL的無花果蛋白酶粗酶液搖勻，在室溫下靜置大約20min，使其分相穩(wěn)定后，測定上下相體積，計算分相體積比R(R=V上相/ V下相)，然后分別測定上下相中的酶活力U。

1.3.3 酶活力測定

將質(zhì)量分數(shù)為2%的酪素溶液放入40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。然后按文獻[8]方法進行測定。

1.3.4 分配系數(shù)計算

分配系數(shù)等于物質(zhì)在兩相的酶活力比。

式中：U上相、U下相分別表示上下相體系酶活力；K表示分配系數(shù)。

當相系統(tǒng)固定時，K為常數(shù)，與溶質(zhì)濃度無關(guān)，只取決于生物物質(zhì)本身的性質(zhì)和特定的兩水相體系的性質(zhì)。酶、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的分配系數(shù)大約在0.01～10之間，兩水相體系對生物物質(zhì)的分配有著很大的選擇性[9]。

1.3.5 PEG/(NH4)2SO4體系相圖繪制

將40% (NH4)2SO4溶液逐滴加入質(zhì)量分數(shù)為40% PEG的濃溶液中，直到形成兩相(恰好出現(xiàn)渾濁)為止，記下此時的體系組成(體系中(NH4)2SO4和PEG的純品質(zhì)量分數(shù))，構(gòu)成相圖雙節(jié)點曲線中的一個點。繼續(xù)向PEG/ (NH4)2SO4混合溶液中加入1g水，搖勻，這時兩相平衡被打破，溶液呈混溶狀態(tài)，待溶液變清后重復(fù)上述操作，到形成兩相時重新記錄兩相物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)形成第2個點；依次操作完成7個點的記錄，將所記錄的體系組成以PEG質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作圖，將各點連線即構(gòu)成兩種物質(zhì)的雙結(jié)點曲線即相圖[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同相對分子質(zhì)量PEG/(NH4)2SO4相圖繪制

在20℃條件下，對相對分子質(zhì)量分別為400、600、1000、2000的PEG/(NH4)2SO4相圖進行繪制，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同相對分子質(zhì)量的PEG/(NH4)2SO4體系相圖Fig.1 Phase diagrams of different molecular weight PEG/(NH4)2SO4 system

圖1 中的曲線是一條雙結(jié)線。聚合物能與水進行無限混溶，當它們的組成位于曲線上方時，體系就會分成兩相，形成無限多個不同組成密度的兩相系統(tǒng)。在這個兩相系統(tǒng)中，上相主要含PEG，下相主要含(NH4)2SO4。伴隨PEG相對分子質(zhì)量從400增大到2000時，其雙節(jié)曲線依次由左向右移動，表現(xiàn)出在相同(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)下，成相所需要的PEG量與相對分子質(zhì)量成反比，這是由于隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大，分子鏈增長，分子間的空間位阻效應(yīng)增強，相互間滲透難度加大；在相同濃度下，伴隨著相對分子質(zhì)量的增大，PEG在水中的摩爾濃度減小，端基數(shù)目降低，極性減弱，疏水性增強，與水的締合能力隨之減弱，和硫酸銨水溶液之間的差異增大，增加了分相推動力，最終導(dǎo)致臨界分相濃度降低。

2.2 不同相對分子質(zhì)量PEG對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響

固定PEG-(NH4)2SO4-水體系中PEG與硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)均為20%，改變PEG相對分子質(zhì)量(400、600、1000、2000)對無花果蛋白酶進行萃取，結(jié)果如圖2所示。

圖2 PEG相對分子質(zhì)量對無花果蛋白酶萃取K值的影響Fig.2 Effect of different molecular weight PEG on ficin partition coefficient

一般來說，同一聚合物的疏水性隨著相對分子質(zhì)量的增大而增大，若想在上相中獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對于PEG應(yīng)降低它的相對分子質(zhì)量。使用PEG400成相時，由于相對分子質(zhì)量過小，成液體狀，體系不能形成兩相。PEG600所形成兩相的K較小，如果K＜1，則說明分配萃取是無效的。PEG2000時其K值明顯下降是因為隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大，分子內(nèi)極性基團的比重降低，導(dǎo)致PEG疏水性增強，溶液的極性下降，加大了上、下兩相間的疏水性程度差距，同時PEG與下相間的表面張力增大，從而降低了無花果蛋白酶的分配系數(shù)。另一方面，PEG的相對分子質(zhì)量越大，相黏度越大，無花果蛋白酶的空間阻礙作用也就越強，加劇向下相富集。許多蛋白在PEG和鹽組成的雙水相體系中有相同的分配行為[11-12]。Vaidya等[13]也認為小分子質(zhì)量的PEG不適合分離蛋白質(zhì)。當PEG相對分子質(zhì)量為1000時，無花果蛋白酶分配系數(shù)最高，達3.4。從分配和操作兩方面來考慮，以PEG1000構(gòu)建兩水相體系進行無花果蛋白酶的萃取分離是有效和可操作的。

2.3 PEG1000質(zhì)量分數(shù)對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響

圖3 PEG1000 質(zhì)量分數(shù)對無花果蛋白酶萃取K值的影響Fig.3 Effect of PEG1000 concentration on ficin partition coefficient

當(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)固定為20%定時，用不同質(zhì)量分數(shù)的PEG1000構(gòu)成PEG/(NH4)2SO4雙水相體系，分別測定無花果蛋白酶在不同的雙水相體系中的分配系數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著PEG1000質(zhì)量分數(shù)的增大，體系離開臨界點距離增大，當體系中PEG1000質(zhì)量分數(shù)為20%時，無花果蛋白酶的分配系數(shù)K為3.4，繼續(xù)增加PEG1000，K值變化趨緩。增大PEG質(zhì)量分數(shù)會增加體系黏度，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，在兩相之間形成乳化層，使下相中的酶分子滯留在兩相之間。一般認為在低PEG質(zhì)量分數(shù)下，分相體積比R是逐漸減小的，當PEG質(zhì)量分數(shù)超過一定值時，R又逐漸增大；從分配理論上解釋，隨PEG質(zhì)量分數(shù)增加，體系黏度增大，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，相界面張力亦增加。當PEG用量較低時，(NH4)2SO4的鹽析作用起主要作用，使酶大部分分配在上相中[14]。增大PEG含量，分相體積比增加，上下相熱力學(xué)特征差異變大，不同物質(zhì)的分配系數(shù)之間的差別也會增大。實驗選擇PEG質(zhì)量分數(shù)為20%構(gòu)成的PEG/(NH4)2SO4雙水相體系為最佳。2.4(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響

在PEG1000質(zhì)量分數(shù)不變的情況下，改變體系中(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)，溫度為室溫，測定各體系分配系數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對無花果蛋白酶萃取K值的影響Fig.4 Effect of (NH4)2SO4concentration on ficin partition coefficient

由圖4可見，在PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)中，固定PEG1000的質(zhì)量分數(shù)為20%，當(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)逐漸增大時分相體積比減??；在一定范圍內(nèi)，分配系數(shù)逐漸增大，當硫酸銨質(zhì)量分數(shù)達19%時，無花果蛋白酶的分配系數(shù)K高達3.6，然后隨(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)增大而下降。這可能是因為硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)過高會破壞酶表面的水化層，使酶發(fā)生鹽析，降低分配系數(shù)[15]。2.5pH值對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響

在20% PEG1000-19% (NH4)2SO4-水體系中，用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH值為5、6、7、8，考察不同pH值對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 體系pH值對無花果蛋白酶萃取K值的影響Fig.5 Effect of pH on ficin partition coefficient

pH值影響蛋白質(zhì)所帶電荷的種類和多少，從而影響蛋白質(zhì)與體系氫鍵和電荷效應(yīng)，最終影響酶在雙水相中的分配行為[16]，同時影響雙水相體系中鹽的解離度而改變相間電位差，如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻，pH值的微小變化甚至可能使蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)改變2～3個數(shù)量級。由圖5可知，在固定其他條件不變，pH值為5～8范圍內(nèi)，無花果蛋白酶的分配系數(shù)K值隨pH值的增大先增大后減小，在體系自身pH值為6時達最大值。

2.6 溫度對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響

在20% PEG1000-19% (NH4)2SO4-水體系中，將體系放入不同溫度環(huán)境下進行靜置分相，考察不同溫度對無花果蛋白酶分配系數(shù)的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對無花果蛋白酶萃取K值的影響Fig.6 Effect of temperature on ficin partition coefficient

由圖6可知，溫度對無花果蛋白酶的分配系數(shù)影響很小，同時酶是對溫度敏感的物質(zhì)，溫度過低會導(dǎo)致其活性被抑制，過高會使其失活?？紤]到這個原因，本實驗在保證溫度不會對酶活性造成不可逆破壞的情況下對20、25、30℃這3個溫度作研究，結(jié)果溫度從20℃增加到30℃時，無花果蛋白酶在兩相中分配系數(shù)K變化不顯著，考慮到操作和成本，實驗在室溫(25℃)下進行。

3 結(jié) 論

相圖的繪制是描述兩相體系分層形成的重要基礎(chǔ)，也是雙水相體系的重要特征。實驗對不同相對分子質(zhì)量PEG的相圖進行繪制，獲得了PEG/(NH4)2SO4體系組成基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；對無花果嫩葉中無花果蛋白酶雙水相萃取的相關(guān)影響因素進行了比較研究，結(jié)果顯示：在PEG/ (NH4)2SO4雙水相體系中PEG相對分子質(zhì)量為1000、PEG質(zhì)量分數(shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)19%，溶液pH6.0、萃取溫度室溫(25℃)時，無花果蛋白酶的分配系數(shù)最大為3.6。

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Partitional Behavior of Ficin in PEG/(NH4)2SO4Two-phase Aqueous System

FENG Zi-li1，MA Na2
(1. Bio-resources Key Laboratory of Shaanxi Province, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China；2. Department of Physics, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)

Aqueous two-phase system (ATPS) was a new and cheap purification method for ficin. The partition of Ficin in polyethylene glycol and ammonium sulfate aqueous two-phase systems was investigated. The effects of PEG molecular weight, polyethylene glycol concentration and ammonium sulfate concentration, pH and temperature on ficin partition coefficient were also explored. Results exhibited that ficin partition coefficient in two-phase aqueous system at the conditions of 20% PEG1000, 19% (NH4)2SO4, pH 6 and temperature at 25 ℃ was 3.6.

ficin；two-phase aqueous system；partition coefficient K

Q814.1

A

1002-6630(2010)19-0067-04

2009-10-08

陜西省教育廳重點實驗室資助項目(08JK245)

馮自立(1979—)，男，講師，碩士，研究方向為天然藥用成分分離與純化技術(shù)。E-mail：fengzili2008@163.com