孫麗萍，徐 響，廖 磊，劉魁英，楊佳林

油菜蜂花粉黃酮醇苷的體內(nèi)外抗氧化研究

孫麗萍1，徐 響1，廖 磊2，劉魁英2，楊佳林1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093； 2.北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所，北京 100035)

以油菜蜂花粉黃酮醇苷組分為原料，以還原力和DPPH自由基清除率為指標研究黃酮醇苷在化學(xué)模擬體系中的抗氧化活性。結(jié)果表明，油菜蜂花粉黃酮醇苷的抗氧化活性不及其苷元成分。以CCl4制備小鼠脂質(zhì)過氧化損傷模型，通過體內(nèi)自由基發(fā)生體系進一步研究花粉黃酮醇苷的抗氧化作用，并對可能的作用機制進行探討。結(jié)果顯示：油菜蜂花粉黃酮醇苷組分能夠顯著地降低脂質(zhì)過氧化小鼠肝勻漿和血清中MDA含量，提高小鼠SOD活性和總抗氧化能力(T-AOC)，對脂質(zhì)過氧化損傷有很好的保護作用，原因可能是體內(nèi)有關(guān)酶系可將黃酮醇苷水解使其游離出酚羥基而發(fā)揮作用。本研究進一步肯定了油菜蜂花粉黃酮醇苷對機體氧化損傷的保護作用。

油菜蜂花粉；黃酮醇苷；抗氧化活性；脂質(zhì)過氧化

蜂花粉是蜜蜂采集的有花植物的雄性生殖細胞，其不僅含有許多營養(yǎng)成分，還含有許多與生命科學(xué)相關(guān)的藥效成分，是傳統(tǒng)的純天然營養(yǎng)保健品。黃酮類化合物具有多方面的生理活性，能增強心臟收縮，減少心臟搏動數(shù)；有止咳祛痰、抗毛細血管脆性和異常透過性、抑制腫瘤細胞作用等[1]。在復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程中，黃酮類化合物具有較強的抗氧化性，對羥自由基具有較好的清除作用[2]，因而能延緩人體衰老?，F(xiàn)已證明蜂花粉具有較強的抗氧化活性[3-4]。本課題組前期研究表明，油菜蜂花粉對酒精性肝損傷有預(yù)防作用[5-6]，其有效組分中不乏黃酮類化合物。

本實驗對油菜蜂花粉醇提物進行分離得到黃酮醇苷組分，采用化學(xué)模擬體系評價其DPPH自由基清除率和還原力，并進行脂質(zhì)過氧化小鼠實驗考察其體內(nèi)抗氧化活性，探討油菜蜂花粉黃酮醇苷對小鼠脂質(zhì)過氧化損傷的影響，并對可能的作用機制進行探討，為油菜蜂花粉中黃酮醇苷的抗氧化性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

清潔級ICR小鼠，70只，雌雄各半，體質(zhì)量22～24g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2006-0009。

油菜蜂花粉(－20℃保藏) 甘肅天水；DPPH、山奈酚、槲皮素 美國Sigma公司；D101大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(批號：20100311)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號：20100322)、超氧化物酶(SOD)測試盒(批號：20100324)南京建成生物工程公司；天然VE(250mg/粒，160粒/瓶批號：2009090665) 海南養(yǎng)生堂藥業(yè)有限公司；甲醇(色譜純) Fisher公司；其他所用試劑均為分析純。

LC-20A高效液相色譜、UV-2550 型紫外-可見分光光度儀、UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 樣品制備

取油菜蜂花粉，超臨界二氧化碳破壁[7]后，加入10倍體積的體積分數(shù)80%的乙醇，在500Hz超聲提取1h，4000r/min離心10min，取沉淀重復(fù)提取一次，合并上清，真空濃縮脫醇后，加入5倍體積的去離子水懸浮，振蕩，4000r/min離心10min，沉淀重復(fù)一次，合并上清，進行D101柱層析(2.5cm×50cm)，用體積分數(shù)50%乙醇洗脫，收集洗脫組分，減壓濃縮干燥，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HPLC分析[8]

Sham-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm)；流動相為甲醇-去離子水，其中去離子水含有體積分數(shù)0.1%的磷酸，甲醇體積分數(shù)為：0～15min，25%；15～35min，25%～75%；35～40min，75%～25%；40～45min，25%；流速：1.0mL/min；波長：370nm；溫度：40℃。1.4化學(xué)模擬體系抗氧化實驗

1.4.1 DPPH自由基清除率測定[9]

DPPH溶液在520nm波長處有特征吸收峰，加入提取液后，以吸光度下降百分率表示DPPH自由基的清除能力。取1mg/mL樣品液2.0mL，加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2.0mL，充分混勻后，于暗處室溫放置30min，測定520nm波長處的吸光度，同時，以80%的乙醇為空白，每個樣品測定3次，求平均值。樣品對DPPH自由基清除率按公式(1)計算。

式中：A空白為2.0mL 80%乙醇加入2.0mL 0.2mmol/L DPPH溶液；A樣品為2.0mL樣品液加2.0mL 0.2mmol/L DPPH溶液；A調(diào)零為2.0mL的80%乙醇加2.0mL樣品液。

1.4.2 還原力的測定[9]

分別準確吸取樣品液1.5mL，加入1.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L)和1.5mL質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃保溫20min后冷卻，加入1.5mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，混合后以5000r/min離心l0min。取上清液2.5mL，加2.5mL去離子水和0.5mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的三氯化鐵溶液，以體積分數(shù)80%乙醇調(diào)零，測定700nm波長處的吸光度，以VC作為標準對照物，將樣品的吸光度換算成每毫克樣品干質(zhì)量含等量VC微克數(shù)表示。

1.5 脂質(zhì)過氧化小鼠實驗[10]

將70只小鼠隨機分4組，分別為空白對照組、四氯化碳組(模型組)、陽性對照組、蜂花粉黃酮醇苷組。空白對照組和四氯化碳組分別灌胃給予生理鹽水10mL/(kg bw·d)，VE組(陽性對照組)灌胃VE 1.0g/(kg bw·d)，樣品組小鼠灌胃給予花粉黃酮醇苷95mg/(kg bw·d)，連續(xù)15d。末次給藥后2h，空白對照組腹腔注射等體積橄欖油，其余各組均腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液10mL/(kg bw·d)。禁食，自由飲水，16h后各組小鼠取血。以3500r/min離心10min，取血清，測定MDA含量和T-AOC、SOD活性；同時取適量肝組織用冰冷生理鹽水沖洗，置冰浴中勻化，制得10%肝勻漿，以4000r/min離心10min，取上清液，測定MDA含量、T-AOC水平MDA含量用硫代巴比妥酸比色法測定，T-AOC水平和SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定，具體步驟均按各試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計方法

使用SPSS11. 0統(tǒng)計軟件包，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，計量資料采用方差分析的One Way 檢驗，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮醇苷組分HPLC分析

油菜蜂花粉黃酮醇苷組分主要含有以山奈酚和槲皮素為苷元的黃酮醇苷化合物，其HPLC圖譜分析見圖1。

圖1 黃酮醇苷組分HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of the flavonoid glycosides-rich rape pollen extract

由圖1可知，15～25min的4個吸收峰經(jīng)HCl酸解后完全消失，而出現(xiàn)了槲皮素和山奈酚的保留時間峰，說明保留時間在15～25min的4種物質(zhì)是槲皮素和山奈酚的黃酮醇苷[11]。

2.2 體外抗氧化活性指標分析

體外抗氧化實驗采用了化學(xué)模擬體系的還原力和DPPH自由基清除實驗，結(jié)果見表1。

表1 還原力和DPPH自由基清除活性Table 1 Reducing power and DPPH free radical scavenging capacity of the flavonoid glycosides-rich rape pollen extract, kaempferol and quercetin

油菜蜂花粉黃酮醇苷組分DPPH半抑制質(zhì)量濃度為119.438μg/mL，說明該組分具有一定的抗氧化活性，但山奈酚和槲皮素DPPH半抑制質(zhì)量濃度分別為9.311μg/mL和5.809μg/mL，遠低于黃酮醇苷組分，說明黃酮醇苷元的抗氧化活性強于黃酮醇苷組分。在兩個苷元成分中，槲皮素的DPPH自由基清除能力更強。還原力實驗顯示出與DPPH自由基清除實驗相同的結(jié)果，每1mg黃酮醇苷組分的還原力相當于43.876μgVC的還原力，而同劑量山奈酚相當于323.208μgVC，槲皮素相當于1032.642μgVC，說明在還原能力方面同樣是槲皮素＞山奈酚＞黃酮醇苷，3個樣品中只有槲皮素的還原能力強于VC。

2.3 體內(nèi)抗氧化活性指標分析

本實驗以脂質(zhì)過氧化小鼠為模型，選用血清和肝勻漿中的MDA含量、T-AOC水平和SOD活性為指標考察花粉黃酮醇苷的抗氧化功效。與空白對照組比較，四氯化碳組小鼠肝組織中MDA含量顯著升高(P＜0.01)，T-AOC水平顯著降低(P＜0.01)；血清中的MDA水平也相應(yīng)升高(P＜0.05)，說明脂質(zhì)過氧化模型造模成功，結(jié)果見表2、3。

2.3.1 油菜蜂花粉黃酮醇苷對脂質(zhì)過氧化小鼠肝臟指標的影響

測定脂質(zhì)過氧化小鼠肝勻漿中MDA含量和T-AOC水平，結(jié)果見表2。

表2 油菜蜂花粉黃酮醇苷對脂質(zhì)過氧化小鼠肝勻漿各指標的影響(x±s，n=10)Table 2 Effect of flavonoid glycosides derived from rape bee pollen on the levels of MDA and T-AOC in mouse liver homogenate (x±s,n=10)

由表2可見，油菜蜂花粉黃酮醇苷組能顯著降低模型組小鼠肝組織中MDA的含量(P＜0.05)，能升高模型組小鼠肝組織中的T-AOC水平，與四氯化碳組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，說明油菜蜂花粉黃酮醇苷組能夠減少小鼠肝組織細胞脂質(zhì)過氧化的速度，抑制肝勻漿中MDA的生成，提高小鼠總抗氧化能力，提示油菜蜂花粉黃酮醇苷能明顯對抗CCl4致肝線粒體脂質(zhì)過氧化。

2.3.2 油菜蜂花粉黃酮醇苷對脂質(zhì)過氧化小鼠血清各指標的影響

測定脂質(zhì)過氧化小鼠血清中MDA含量和SOD活性、T-AOC水平，結(jié)果見表3。

表3 油菜蜂花粉黃酮醇苷對脂質(zhì)過氧化小鼠血清抗氧化指標的影響(x±s，n=10)Table 3 Effect of flavonoid glycosides derived from rape bee pollen on the levels of MDA, SOD and T-AOC in mouse serum (x±s, n=10)

如表3所示，血清各項抗氧化指標中，與四氯化碳組對比，油菜蜂花粉黃酮醇苷組MDA含量降低，SOD活性、T-AOC顯著地提高(P＜0.05)，表明油菜蜂花粉黃酮醇苷可增強機體清除自由基和抗氧化能力，對CCl4所致的脂質(zhì)過氧化具有明顯抑制作用。油菜蜂花粉黃酮醇苷組的實驗劑量僅為VE組的1/10，但黃酮醇苷組增加SOD活性、T-AOC的效果好于VE。

3 討 論

3.1 油菜蜂花粉黃酮醇苷對抗肝脂質(zhì)過氧化的作用及機制

本實驗研究顯示，小鼠經(jīng)CCl4致毒后，肝組織和血清中MDA含量較對照組顯著增加，表明CCl4誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)模型復(fù)制成功。黃酮醇苷預(yù)處理的小鼠在CCl4攻擊下肝組織中MDA含量明顯低于模型組(P＜0.05)，T-AOC水平明顯高于模型組(P＜0.05)；同時，血清中MDA含量低于模型組，而SOD和T-AOC水平也明顯高于模型組(P＜0.05)。說明油菜蜂花粉黃酮醇苷明顯抑制實驗小鼠肝組織和血清中MDA的異常升高，顯著提高SOD活性和T-AOC，從而起到抗脂質(zhì)過氧化的作用，其機制可能發(fā)生在多個環(huán)節(jié)：1)減少自由基、活性氧的生成；2)改善微循環(huán)；3)增加SOD活性；4)提高T-AOC；從而加速自由基、活性氧的清除。

3.2 黃酮醇苷體內(nèi)外抗氧化差異產(chǎn)生的原因

研究表明，黃酮苷元清除人體氧自由基的生物活性明顯優(yōu)于黃酮糖苷，黃酮苷元的效價是黃酮糖苷效價的7倍。黃酮苷元的生物活性之所以大大優(yōu)于黃酮糖苷，是因為黃酮類化合物在動物體內(nèi)代謝時，僅有苷元型黃酮可以直接被吸收進入動物血液中，而大部分糖苷型的黃酮化合物在人體內(nèi)不能通過小腸壁進入到血液中，而是被腸腔內(nèi)微生物通過雜環(huán)裂解方式降解和代謝，其中僅有小部分黃酮在結(jié)腸內(nèi)益生菌(如乳酸菌和雙歧桿菌)分泌的水解酶作用下，產(chǎn)生苷元再重新吸收進入血液[12]。大腸中存在大量的厭氧菌產(chǎn)生α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、內(nèi)-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖碳苷酶等多種糖苷酶參與水解黃酮苷類化合物的各種糖苷鍵，能水解O-糖苷以及C-糖苷，腸菌水解生成的黃酮苷元一部分被大腸直接吸收，另外一部分被進一步裂解，產(chǎn)生小分子酚酸類成分被吸收入血液[13]。

因此，在非酶體系的DPPH自由基清除實驗中黃酮醇苷的清除活性明顯弱于其苷元的活性，而在脂質(zhì)過氧化小鼠實驗中黃酮醇苷具有很好的抗氧化活性，可能是由于體內(nèi)有關(guān)酶系可將黃酮醇苷水解使其游離出酚羥基而發(fā)揮作用[14]。

4 結(jié) 論

本研究以花粉黃酮醇苷組分為原料，以還原力和DPPH自由基清除率為指標考察花粉黃酮醇苷在化學(xué)模擬體系中的抗氧化活性。結(jié)果表明，黃酮醇苷的抗氧化活性不及其苷元成分。以CCl4制備小鼠脂質(zhì)過氧化損傷模型，通過體內(nèi)自由基發(fā)生體系進一步研究了花粉黃酮醇苷的抗氧化作用，結(jié)果顯示，花粉黃酮醇苷能夠顯著地降低脂質(zhì)過氧化小鼠肝勻漿和血清中MDA含量，提高小鼠SOD活性和T-AOC，對脂質(zhì)過氧化損傷有很好的保護作用，其原因可能是體內(nèi)有關(guān)酶系可將黃酮醇苷水解使其游離出酚羥基而發(fā)揮作用。

[1]肖崇厚. 中藥化學(xué)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1987: 193.

[2]丁利君, 沈建毅. 黃芪中黃酮類化合物提取及其對羥自由清除作用[J]. 食品與機械, 2002(3): 20-21.

[3]LUTHRIA D L. Significance of sample preparation in developing analytical methodologies for accurate estimation of bioactive compounds in functional foods[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86(14): 2266-2272.

[4]SILVA T M S, CAMARA C A, da SILVA LINS A C, et al. Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen stingless bee melipona ducke[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2006, 19(11): 507-511.

[5]孫麗萍, 王大仟, 廖磊, 等. 油菜蜂花粉及其提取物對大鼠酒精性肝損傷組織學(xué)影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 442-444.

[6]孫麗萍, 王大仟, 廖磊, 等. 油菜蜂花粉對大鼠酒精性肝損傷防治的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 543-545.

[7]孫麗萍, 徐響. 超臨界二氧化碳處理對油菜蜂花粉破壁的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(6): 56-58.

[8]楊佳林, 孫麗萍, 徐響, 等. 油菜蜂花粉黃酮醇的測定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3): 79-82.

[9]孫麗萍, 楊佳林, 徐響, 等. 油菜蜂花粉酚類化合物的初步分離和抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(23): 33-35.

[10]林興, 黃權(quán)芳, 張士軍, 等. 六月青總皂苷對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響[J]. 中成藥, 2009, 31(12): 1937-1939.

[11]楊佳林, 孫麗萍, 徐響, 等. 油菜蜂花粉黃酮醇的測定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3): 79-82.

[12]吳超, 蘇紅利, 張曉鳴. 銀杏葉提取物制取黃酮苷元的酶解工藝研究[J]. 食品與機械, 2005, 21(6): 27-31.

[13]許妍妍, 張煜. 蜂膠與冠心病心絞痛[J]. 吉林醫(yī)學(xué), 2009, 30(3): 273-275.

[14]陳時宏. 黃酮類化合物的抗氧作用及其構(gòu)效關(guān)系[J]. 海峽藥學(xué), 1998, 10(4): 4-6.

Anti-oxidant Effect of Flavonoid Glycosides from Rape Bee Pollen

SUN Li-ping1，XU Xiang1，LIAO Lei2，LIU Kui-ying2，YANG Jia-lin1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Beijing Clinical Pharmacy Institute, Beijing 100035, China)

Flavonoid glycosides were prepared from rape bee pollen, and their ability to scavenge DPPH free radicals and reducing power in simulated chemical systems were determined. The antioxidant activity of the extracted flavonoid glycosides was not as strong as that of kaempferol or quercetin. The antioxidant activity of the extracted compounds in vivo against CCl4-induced lipid peroxidation in mice was investigated, and the antioxidant mechanisms were also elucidated. The results showed that the extract could significantly inhibit the generation of MDA in liver, and increase the level of T-AOC in liver and serum. The possible antioxidant mechanism was the generation of flavonoid aglycone with plentiful antioxidant phenolic groups due to the hydrolysis of flavonoid glycosides by in vivo relevant enzymes. Therefore, flavonoid glycosides derived from rape bee pollen had a good protective effect against in vivo oxidative damage.

rape bee pollen；flavonoid glycosides；antioxidant activity；lipid peroxidation

S896.4

A

1002-6630(2010)19-0359-04

2010-06-28

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(nyhyzx07-041)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(NYCYTX-43)；

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研經(jīng)費項目

孫麗萍(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品功能因子的分離與純化。E-mail：caasun@126.com