朱科學(xué)，聶少平，李文娟，余 強(qiáng)，張莘莘，謝明勇*

黑靈芝多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的影響

朱科學(xué)，聶少平，李文娟，余 強(qiáng)，張莘莘，謝明勇*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330047)

目的：研究黑靈芝多糖(PSG-1)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的影響。方法：采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)PSG-1在不同質(zhì)量濃度、不同時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，檢測(cè)不同質(zhì)量濃度PSG-1單獨(dú)作用及其與絲裂原共同作用對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖作用的影響；用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定白介素-2 (IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果：PSG-1在20～160μg/mL質(zhì)量濃度范圍能顯著促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，且48h效果最佳；PSG-1能顯著增強(qiáng)刀豆蛋白A (Con A)誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖作用；并且能顯著誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2和TNF-α。結(jié)論：PSG-1能有效的促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，并與Con A、LPS對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用，還可以通過IL-2和TNF-α發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

黑靈芝多糖；脾淋巴細(xì)胞；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)；白介素-2 (IL-2)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)

靈芝為多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體，在我國作為藥物已有2000多年的歷史。靈芝的有效成分非常豐富，目前已知的有多糖、麥角甾醇、三萜類、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽等十大類，約150多種[1]。以往研究表明多糖是靈芝發(fā)揮生物活性的主要成分之一，其主要的藥理作用為增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤[2]。脾臟是人體最大的免疫器官，是T、B淋巴細(xì)胞聚集的部位[3]，而T、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其激活、分化、增殖在免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用[4]。目前，國內(nèi)外研究過的靈芝屬真菌僅有赤芝、紫芝、樹舌、薄蓋靈芝、南方靈芝5種，其中赤芝研究最多，紫芝次之[5]，但有關(guān)黑靈芝多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究國內(nèi)外鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以江西贛南出產(chǎn)的黑靈芝為研究對(duì)象，研究黑靈芝多糖(PSG-1)對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和誘生細(xì)胞因子的影響，初步研究PSG-1的免疫調(diào)節(jié)作用，旨在為黑靈芝的深入開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑靈芝多糖[6]本實(shí)驗(yàn)室制備。

BALB/c純系小鼠，體質(zhì)量25～30g，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科。

胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、刀豆蛋白A (Con A) 、脂多糖(LPS) 美國Sigma公司；小鼠IL-2和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒 南京建成科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Toshiba公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；TGL216G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；680型自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀 美國Thermo公司；高壓滅菌裝備 上海醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備

參照文獻(xiàn)[7-9]，頸椎脫臼處死小鼠，用碘伏浸泡5min，再用75%乙醇浸泡小鼠3min，沿腹腔中線剪開小鼠腹腔，取出脾臟置于培養(yǎng)皿中，剪去脂肪和筋膜組織，用RPMI-1640培養(yǎng)液漂洗。置組織于研磨器中加入適量PBS液研磨，制成脾細(xì)胞懸液，過200目篩網(wǎng)，將得到的細(xì)胞懸液置于離心管中，1500r/min離心15min。棄上層清液，加入Tris-NH4Cl溶液9倍體積0.83g/100mL的NH4Cl溶液與1倍體積2.06g/100mL的Tris-HCl溶液(pH7.65)混合，用NH4Cl調(diào)節(jié)pH值至7.2)裂解紅細(xì)胞，室溫靜置5min，以除去紅細(xì)胞，見離心后所得為白色沉淀上方只有一層紅色膜為最佳狀態(tài)，用RPMI-1640培養(yǎng)液1000r/min離心10 min洗滌細(xì)胞3次，以除去剩余的氯化銨。將上述收集到的脾細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，以除去貼壁細(xì)胞，收集未貼壁的細(xì)胞懸液即為脾淋巴細(xì)胞。計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%。

1.2.2 PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用最佳濃度及最佳時(shí)間的考察

取小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL。 PSG-1實(shí)驗(yàn)組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入195.5μL/孔脾淋巴細(xì)胞懸液，再各加入2.5μL不同質(zhì)量濃度的PSG-1，最后各加2μL的RPMI-1640培養(yǎng)液使 PSG-1的最終質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320μg/mL。每一濃度4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72h后每孔加MTT 20μL(5g/L)繼續(xù)孵育4h，棄去上清，然后每孔加入150μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，變色后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光度A570nm，作為脾淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)[10]。

1.2.3 PSG-1對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

同1.2.1節(jié)方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，檢測(cè)PSG-1對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖作用。PSG-1對(duì)Con A誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖作用，PSG-1+Con A組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入195.5μL/孔脾淋巴細(xì)胞懸液，再每孔加入2.5μL不同質(zhì)量濃度的PSG-1，最后各加2μL含Con A的RPMI-1640培養(yǎng)液(含Con A終質(zhì)量濃度為10μg/mL)；PSG-1對(duì)LPS誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的增殖作用，PSG-1+LPS組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入195.5μL/孔脾淋巴細(xì)胞懸液，再每孔加入2.5μL不同質(zhì)量濃度的PSG-1，最后各加2μL含LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液(含LPS終質(zhì)量濃度為100μg/mL)。每一質(zhì)量濃度4個(gè)復(fù)孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養(yǎng) 48h后每孔加MTT 20μL(5g/L)繼續(xù)孵育4h，棄去上清，然后每孔加入150μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，變色后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光度A570nm。

1.2.4 IL-2、TNF-α的誘生

同1.2.1節(jié)方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，加入到96孔培養(yǎng)板中，設(shè)對(duì)照組及PSG-1組(PSG-1的終質(zhì)量濃度為25、50、100μg/mL)，每一質(zhì)量濃度4個(gè)復(fù)孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養(yǎng)48h，收集上清液測(cè)定細(xì)胞因子含量。

1.2.5 細(xì)胞上清液中IL-2和TNF-α含量的測(cè)定

嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作流程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出上清液中IL-2和TNF-α的濃度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

組間差異采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 17.0 作單因素ANOVA處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以表示，以P＜0.05時(shí)，組間差異判斷為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖1 PSG-1不同質(zhì)量濃度、不同時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of PSG-1 with different concentrations on spleen lymphocyte proliferation at various times

由圖1可以看出，PSG-1在終質(zhì)量濃度5～320μg/mL范圍內(nèi)可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中在20～160μg/mL范圍內(nèi)促進(jìn)效果顯著。同時(shí)，對(duì)PSG-1不同作用時(shí)間分析表明，在PSG-1刺激24、48、72h后，小鼠脾淋巴細(xì)胞均可顯著增殖，其中作用48h增殖幅度大，表明PSG-1作用48h對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖效果顯著。

2.2 不同質(zhì)量濃度PSG-1和絲裂原共同作用對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

圖2 PSG-1與Con A及LPS共同作用48h對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig.2 Effect of PSG-1 with Con A or LPS on the proliferation of spleen lymphocyte during 48 h period

由圖2可知，PSG-1在5～320μg/mL范圍內(nèi)對(duì)Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖均有協(xié)同作用，且在20～160μg/mL范圍內(nèi)協(xié)同作用更為顯著。表明PSG-1對(duì)Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用。

2.3 PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外誘生IL-2和TNF-α的影響

在上述確定的PSG-1最佳作用質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，選定25、50、100μg/mL三個(gè)劑量以檢測(cè)PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外誘生IL-2和TNF-α的影響，測(cè)定結(jié)果見圖3。結(jié)果表明：培養(yǎng)液中添加PSG-1能顯著增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和TNF-α的分泌，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并隨著PSG-1質(zhì)量濃度的增加，IL-2和TNF-α的分泌量也增加，存在著明顯的量效關(guān)系。

圖3 PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外誘生IL-2含量和TNF-α含量的影響Fig.3 Effect of PSG-1 on IL-2 and TNF-α induction of spleen lymphocyte in vitro

3 討 論

脾臟淋巴細(xì)胞中含有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，它們均是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PSG-1對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的促增殖作用顯著，并存在明顯的量效關(guān)系。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)成功地建立了小鼠脾淋巴細(xì)胞Con A和LPS誘導(dǎo)模型，Con A作為T淋巴細(xì)胞有絲分裂原，主要促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，LPS主要促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖[12]。本研究表明，PSG-1與Con A、LPS共同作用均對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)具有明顯的促進(jìn)作用，由此推斷PSG-1可能是淋巴細(xì)胞的致有絲分裂原，通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的目的，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能具有重要的意義。

細(xì)胞因子是一類由活化的免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等)和相關(guān)細(xì)胞(纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)多肽分子或糖蛋白[13]，是免疫系統(tǒng)重要的信息分子，在免疫調(diào)節(jié)中充當(dāng)十分重要的角色[14]，如IL-2和TNF-α是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中重要的調(diào)節(jié)因子。

1986年，Mosmann等[15]根據(jù)輔助T細(xì)胞活化后分泌細(xì)胞因子的不同將其分為Th1和Th2細(xì)胞。IL-2主要是由活化的Th1細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的一種有效的T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤方面有非常重要的作用；同時(shí)也是調(diào)節(jié)Th細(xì)胞亞型Th1和Th2細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素之一[16]。IL-2的分泌能促使Th0細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th1細(xì)胞[17]，并促進(jìn)Th1細(xì)胞自身的增殖和分化[16]；同時(shí)IL-2與T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞表面的IL-2受體結(jié)合后，能引起T細(xì)胞分化、增殖，促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性[18]；其分泌水平高低可以反映機(jī)體的免疫功能，特別是細(xì)胞免疫功能[19]，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用[20]。本實(shí)驗(yàn)研究了不同質(zhì)量濃度PSG-1對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外誘生IL-2的影響，結(jié)果表明，PSG-1可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞IL-2的分泌，且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。由此推斷PSG-1能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖與分化，進(jìn)而對(duì)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能起促進(jìn)作用。

TNF-α由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子；不僅能夠直接的抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，而且能激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞功能以及促進(jìn)抗原活化T、B淋巴細(xì)胞增殖、分化等作用，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[21]。本研究在25、50、100μg/mL PSG-1作用下培養(yǎng)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞48h后測(cè)定上清中TNF-α的含量，研究發(fā)現(xiàn)，PSG-1能劑量依賴性地增加脾淋巴細(xì)胞TNF-α的分泌，表明PSG-1可以通過促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，這也可能是其抗腫瘤的途徑之一。

綜上所述，PSG-1能有效的促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并與Con A、LPS對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用，還可以通過促進(jìn)IL-2和TNF-α的分泌發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。表明PSG-1可能是通過促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞IL-2和TNF-α分泌量的增加而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

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Effect of Polysaccharides from Ganoderma atrum on Spleen Lymphocyte Proliferation and Induction of Cytokine in Mice

ZHU Ke-xue，NIE Shao-ping，LI Wen-juan，YU Qiang，ZHANG Shen-shen，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To investigate the effect of polysaccharides from Ganoderma atrum (PSG-1) on spleen lymphocyte proliferation and induction of cytokine in mice. Methods: The effects of treatments with PSG-1 and with PSG-1 containing motigen at different concentrations on spleen lymphocyte proliferation were determined by MTT. The contents of IL-2 and TNF-α were determined by using ELISA. Results: PSG-1 at a concentration ranging from 20 to160 μg/mL resulted in a significant increase of lymphocyte proliferation, and 48 h administration gave the best proliferation. PSG-1 could also enhance the effect of Con A-induced T lymphocyte proliferation and the stimulation index of LPS-induced B lymphocytes. Moreover, PSG-1 could significantly increase the secretion of IL-2 and TNF-α in spleen lymphocyte. Conclusion: PSG-1 can effectively increase lymphocyte proliferation and enhance the effect of Con A, LPS-induced T and B cell growth. PSG-1 has the ability to enhance immune responses by increasing the secretion of IL-2 and TNF-α.

Ganoderma atrum polysaccharides；spleen lymphocyte；MTT；ELISA；IL-2；TNF-α

Q946.3；Q952.6

A

1002-6630(2010)19-0351-04

2010-06-23

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z325)；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向資助項(xiàng)目(SKLF-MB-200806)；江西省科技廳科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目

朱科學(xué)(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：zhukexue163@163.com

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品化學(xué)、食品營養(yǎng)與安全研究。E-mail：myxie@ncu.edu.cn