鄭 征，葛銀林*，薛美蘭，秦偉偉，徐艷君，侯 琳

n-3多不飽和脂肪酸飲食對小鼠肥胖及相關細胞因子的影響

鄭 征，葛銀林*，薛美蘭，秦偉偉，徐艷君，侯 琳

(青島大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021)

目的：研究n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fat acids，PUFAs)飲食對小鼠肥胖程度及相關細胞因子血清水平的影響，探討其作用機理。 方法：將健康小鼠分為高飽和脂肪酸飲食組、n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組，記錄每周小鼠進食量和體質量，實驗結束時用ELISA法檢測小鼠血清增食因子A(orexin-A)、抵抗素(resistin)、脂聯(lián)素(adiponectin)水平。 結果：n-3多不飽和脂肪酸飲食組小鼠與高飽和脂肪酸飲食組小鼠相比，肥胖程度明顯降低 (P＜0.05)，血清的增食因子A水平明顯降低(P＜0.05)，血清的抵抗素水平明顯升高(P＜0.05)，血清的脂聯(lián)素水平升高但無統(tǒng)計學差異；n-3多不飽和脂肪酸飲食組小鼠的各項指標和對照組相比均無統(tǒng)計學差異。結論：n-3多不飽和脂肪酸飲食與飽和脂肪酸飲食相比，可抑制肥胖的發(fā)生和發(fā)展。

n-3多不飽和脂肪酸；肥胖；脂聯(lián)素；增食因子A；抵抗素

肥胖(obesity)是機體中能量攝入大于能量消耗的一種慢性能量失衡，且多余體脂的積累對身體健康產(chǎn)生不利影響?，F(xiàn)代社會肥胖癥的發(fā)病率越來越高，由于肥胖的發(fā)生可導致高血壓(hypertension)、2型糖尿病(type 2 diabetes)、代謝綜合癥(metabolic syndrome，MS)等疾病，嚴重威脅人類健康，因此肥胖癥已成為目前世界范圍內最受關注的代謝類疾病之一[1]。

食用油是人們日常生活中必須攝入的營養(yǎng)物質，除提供人體熱能、必需脂肪酸(essential fatty acids，EFA)和促進脂溶性維生素(lipid soluble vitamin)吸收外，還有利于增強進食口感。食用油的攝入量、種類及脂肪酸組成，能夠顯著地影響人體中多種脂類和類脂水平的變化，從而對肥胖和相關疾病起到重要的調節(jié)作用[2-4]。食用油來源于動物脂肪和植物油脂，可分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid)。根據(jù)不飽和雙鍵的位置，可將不飽和脂肪酸劃分3類：n-3不飽和脂肪酸、n-6不飽和脂肪酸和n-9不飽和脂肪酸。其中n-3不飽和脂肪酸均為多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fat acids，PUFAs)，近年來發(fā)現(xiàn)它在腫瘤、心腦血管疾病、心臟病、風濕疾病、代謝疾病、帕金森等疾病的預防和治療方面有顯著功效，并且對于新生兒及幼兒的大腦、中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用[5-8]。

為探討n-3多不飽和脂肪酸飲食在治療肥胖癥和其并發(fā)癥中的作用，本研究以C57BL/6小鼠為實驗動物，建立高飽和脂肪酸飲食組、n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組3個飲食模型組，觀察小鼠的肥胖程度以及小鼠血清中脂聯(lián)素、增食因子A和抵抗素的表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SPF級C57BL/6雌性小鼠 上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

標準實驗動物飼料 濟南康大飼料有限公司；脫脂大豆粉 青島美辰食品公司；脫脂甜奶粉 雀巢公司；維生素AD膠丸 青島雙鯨藥業(yè)有限公司；深海魚油 美國康隆公司；其他配料購自沃爾瑪超市。各組飼料配方見表1，飼料制備后4℃低溫保存。

表1 各組飼料成分配方(100g)Table 1 Diet formula composition (100g)

血清脂聯(lián)素ELISA試劑盒(mouse)、血清增食因子ELISA試劑盒(mouse)、血清抵抗素ELISA試劑盒(mouse) 上海西唐公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀(配有Ascent software for Multiskan分析軟件)、Wellwash 4 MK2洗板機 芬蘭Thermo公司；SIGMG 1-13離心機 美國Sigma公司；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；DW-86L626超低溫冰箱、BCD-196TE冰箱 海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和實驗設計

36只雌性C57BL/6小鼠，適應性喂養(yǎng)兩周后，體質量20.34～24.34g。隨機分為高飽和脂肪酸飲食組、n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組。高飽和脂肪酸飲食組體質量：(21.59±0.22)g；n-3多不飽和脂肪酸飲食組體質量：(21.86±0.28)g；對照組體質量：(21.62± 0.52)g。每組分為3籠，自由攝食飲水。實驗動物房溫度(22±5)℃，濕度(50±10)%，明暗周期12/12。每周記錄每只小鼠的體質量和每籠小鼠的進食量。第18周末時采用頸椎脫臼法處死小鼠，記錄每只小鼠肛門到鼻尖的長度作為體長，斷頭采血后分離血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清中脂聯(lián)素(adiponectin)、增食因子A(orexin-A)和抵抗素(resistin)的含量。

1.3 測定方法

小鼠斷頭采血0.5～2mL，室溫下靜置2h，3000r/min離心20min，分離到血清50～150μL，－70℃低溫保存。分別按照小鼠血清中脂聯(lián)素、小鼠增食因子A和小鼠抵抗素的酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書要求，檢測3種細胞因子的濃度。

以每周稱質量的小鼠體質量減去小鼠初始體質量得到每周體質量增加；每籠每周進食量除以每籠小鼠個數(shù)計算出每周平均進食量；將實驗結束時小鼠的體質量體長比作為衡量小鼠肥胖程度的指標。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對每周平均進食量、每周體質量增加量以及體質量體長比作統(tǒng)計學分析，用t檢驗(t-test)進行各飲食模型組間的兩兩比較；采用線性回歸(linear regression)和相關性分析(correlation analysis)分析各飲食模型組的每周平均進食量和每周體質量增加量之間的關系；采用t檢驗分析各飲食模型組之間的血清脂聯(lián)素、增食因子A和抵抗素水平是否有顯著性差異。顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 體質量、體長和進食量的測定結果

對3個飲食模型組小鼠的每周體質量增加量和體質量體長比做單因素方差分析和組間兩兩t檢驗，發(fā)現(xiàn)高飽和脂肪酸飲食組小鼠的每周體質量增加量的平均值(P＜0.01)和體質量體長比(P＜0.05)均顯著高于n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組；而n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組之間無顯著性差異(圖1、2)。表明高飽和脂肪酸飲食組小鼠的肥胖程度顯著高于另外兩組。

圖1 3組小鼠每周體質量增加量均值Fig.1 ANOVA analysis of body weight difference between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

圖2 3組小鼠的體質量體長比Fig.2 ANOVA analysis of weight/length ratio difference between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

對3個飲食模型組小鼠的每周體質量增加量和每周平均進食量做線性回歸和相關性分析，發(fā)現(xiàn)高飽和脂肪酸飲食組小鼠的每周平均進食量顯著高于n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組(P＜0.001)，高飽和脂肪酸飲食組小鼠的每周體質量增加與每周平均進食量呈負相關(r=－0.576)，而n-3多不飽和脂肪酸飲食組(r=0.694)和對照組(r=0.701)的每周體質量增加與每周平均進食量呈正相關(圖3、4)。表明高飽和脂肪酸飲食組小鼠的食欲高于另外兩組，隨著體質量的增加進食量有減少趨勢；n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組的進食量隨體質量增長穩(wěn)定增加。

圖3 3組小鼠每周平均進食量的線性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis of weekly food intake of mice

圖4 3組小鼠每周體質量增加的線性回歸分析Fig.4 Linear regression analysis of weekly body weight increment of mice

2.2 小鼠血清中3種細胞因子水平的測定結果

對3個飲食模型組小鼠的血清脂聯(lián)素、增食因子A和抵抗素水平做單因素方差分析和組間兩兩t檢驗，發(fā)現(xiàn)高飽和脂肪酸飲食組小鼠血清增食因子A顯著高于另外兩組(P＜0.05)，抵抗素水平顯著低于另外兩組(P＜0.05)，血清脂聯(lián)素水平低于另外兩組，但沒有統(tǒng)計學意義(P=0.71)；n-3多不飽和脂肪酸飲食組和對照組之間沒有顯著性差異(圖5)。

圖5 血清中3種細胞因子水平與飲食類型關系Fig.5 Statistical analysis of differences in three obesity-related cellfactors between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

3 結 論

n-3多不飽和脂肪酸是一類重要的多不飽和脂肪酸，主要包括α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)、二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid，ETA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。其中EPA和DHA的攝入可以顯著降低高脂血癥患者的脂類、脂蛋白和載脂蛋白的血清水平；增強2型糖尿病患者體內胰島素敏感性，緩解胰島素抵抗，降低血漿甘油三酯、類脂和脂蛋白水平；降低健康成人的體脂含量，促進脂肪利用[9-12]。本實驗中，C57BL/6小鼠作為一種容易誘發(fā)飲食誘導肥胖(diet-induced obese，DIO)的小鼠品系，長期給其喂食添加n-3多不飽和脂肪酸的食物后，可有效的控制其肥胖的發(fā)生，降低其肥胖程度，說明EPA和DHA對小鼠有減肥作用，該結果與相關報道一致[12]。

肥胖的發(fā)生和發(fā)展與多種細胞因子有關。增食因子A又稱為下丘腦分泌素1(hypocretin-1)，由下丘腦分泌素細胞分泌。下丘腦分泌細胞的分泌作用可被瘦素(leptin)和高血糖狀態(tài)抑制，而被饑餓素(ghrelin)和低血糖狀態(tài)激活，據(jù)此發(fā)現(xiàn)增食因子A有增強食欲、增加進食量和加速分解代謝的作用[13-15]。在本實驗中，添加EPA和DHA的飼料對小鼠的食欲有降低作用。食用了EPA和DHA的小鼠與高飽和脂肪酸飲食小鼠相比，血清中增食因子A水平相對降低。作為一種調節(jié)食欲的細胞因子，增食因子A的血清水平降低的同時，小鼠食欲也降低，這可能是由于EPA和DHA的攝入使小鼠在進食后容易產(chǎn)生飽感，小鼠下丘腦的食欲調節(jié)網(wǎng)路(appetite regulation network，ARN)通過各種信號傳遞作用，降低了增食因子A的表達。與對照組相比，n-3多不飽和脂肪酸飲食組小鼠的進食量和增食因子A血清水平雖無顯著性差異，但通過飼養(yǎng)過程中的外觀觀察，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠的毛色略暗且不柔順，個別有脫毛的現(xiàn)象，營養(yǎng)狀況較差。

抵抗素是由脂肪細胞分泌的與能量代謝密切相關的細胞因子，其具體作用還存在爭議。有研究表明，生理條件下個體肥胖程度的增加可提高血清抵抗素的水平，而血清抵抗素水平增加則促使胰島素抵抗(insulin resistance)程度的增加，從而減緩血糖貯存為體脂的趨勢[16-19]。本實驗中，n-3多不飽和脂肪酸飲食組小鼠的血清抵抗素水平明顯高于高飽和脂肪酸飲食組，提示EPA和DHA的攝入可能是通過提高抵抗素的血清水平來調節(jié)胰島素敏感性(insulin sensitivity)，從而減少脂肪的積累的。

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌進入血液循環(huán)的一種蛋白類激素，對多種物質的代謝起調節(jié)作用，包括葡萄糖的調節(jié)和脂肪酸的異化作用，其表達水平和成年人體脂含量負相關[20-22]。本實驗中，體質量顯著降低的n-3多不飽和脂肪酸飲食組小鼠的血清脂聯(lián)素水平略有升高，雖無統(tǒng)計學意義，但與相關報道一致[21]。

本實驗通過觀察每周小鼠的進食量及體質量，檢測小鼠脂聯(lián)素、增食因子A和抵抗素的血清水平，進一步驗證了n-3多不飽和脂肪酸飲食的減肥功效，并認為其減少體脂的作用可能是通過減低食欲和調節(jié)胰島素敏感性來實現(xiàn)的。然而，人們對通過神經(jīng)-體液調節(jié)(neuro-humoral regulation)途徑控制肥胖發(fā)生的食欲調節(jié)網(wǎng)路還不甚明了，脂聯(lián)素等細胞因子在食欲調節(jié)網(wǎng)路中的地位及其對胰島素的具體作用方式還有待進一步的研究。因此，確證n-3多不飽和脂肪酸是通過調節(jié)食欲和胰島素敏感性來實現(xiàn)其減肥作用、明確具體的減肥機制是進一步研究的重點。另外，在人體內是否能得到和小鼠相似的結果，也是進一步研究的方向。

[1]HASLAM D W, JAMES W P. Obesity[J]. Lancet, 2005, 366(9492): 1197-1209.

[2]CALDER P C. Polyunsaturated fatty acids and inflammatory processes: New twists in an old tale[J]. Biochimie, 2009, 91(6): 791-795.

[3]GUIVERNAU M, MEZA N, BARJA P, et al. Clinical and experimental study on the long-term effect of dietary gamma-linolenic acid on plasma lipids, platelet aggregation, thromboxane formation, and prostacyclin production[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1994, 51(5): 311-316.

[4]FAN Yangyi, CHAPKIN R S. Importance of dietary gamma-linolenic acid in human health and nutrition[J]. J Nutr, 1998, 128(9): 1411-1414. [5]BUCHER H C, HENGSTLER P, SCHINDLER C, et al. N-3 Polyunsaturated fatty acids in coronary heart disease: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Med, 2002, 112(4): 298-304.

[6]de DECKERE E A. Possible beneficial effect of fish and fish n-3 polyunsaturated fatty acids in breast and colorectal cancer[J]. Eur J Cancer Prev, 1999, 8(3): 213-221.

[7]SINN N, BRYAN J. Effect of supplementation with polyunsaturated fatty acids and micronutrients on learning and behavior problems associated with child ADHD[J]. J Dev Behav Pediatr, 2007, 28(2): 82-91.

[8]BOUSQUET M, SAINT-PIERRE M, JULIEN C, et al. Beneficial effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acid on toxin-induced neuronal degeneration in an animal model of Parkinson s disease[J]. FASEB J, 2008, 22(4): 1213-1225.

[9]PHILLIPSON B E, ROTHROCK D W, CONNOR W E, et al. Reduction of plasma lipids, lipoproteins, and apoproteins by dietary fish oils in patients with hypertriglyceridemia[J]. N Engl J Med, 1985, 312(19): 1210-1216.

[10]POPP-SNIJDERS C, SCHOUTEN J A, HEINE R J, et al. Dietary supplementation of omega-3 polyunsaturated fatty acids improves insulin sensitivity in non-insulin-dependent diabetes[J]. Diabetes Res, 1987, 4(3): 141-147.

[11]MALASANOS T H, STACPOOLE P W. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 1991, 14(12): 1160-1179.

[12]COUET C, DELARUE J, RITZ P, et al. Effect of dietary fish oil on body fat mass and basal fat oxidation in healthy adults[J]. Int J Obes Relat Metab Disord, 1997, 21(8): 637-643.

[13]SAKURAI T, AMEMIYA A, ISHII M, et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J]. Cell, 1998, 92(4): 573-585.

[14]WILLIAMS K W, SCOTT M M, ELMQUIST J K. From observation to experimentation: leptin action in the mediobasal hypothalamus[J]. Am J Clin Nutr, 2009, 89(Suppl 3): 985-990.

[15]HEWSON A K, TUNG L Y, CONNELL D W, et al. The rat arcuate nucleus integrates peripheral signals provided by leptin, insulin, and a ghrelin mimetic[J]. Diabetes, 2002, 51(12): 3412-3419.

[16]DEGAWA-YAMAUCHI M, BOVENKERK J E, JULIAR B E, et al. Serum resistin (FIZZ3) protein is increased in obese humans[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(11): 5452-5455.

[17]ASENSIO C, CETTOUR-ROSE P, THEANDER-CARRILLO C, et al. Changes in glycemia by leptin administration or high- fat feeding in rodent models of obesity/type 2 diabetes suggest a link between resistin expression and control of glucose homeostasis[J]. Endocrinology, 2004, 145(5): 2206-2213.

[18]RAJALA M W, QI Yong, PATEL H R, et al. Regulation of resistin expression and circulating levels in obesity, diabetes, and fasting[J]. Diabetes, 2004, 53(7): 1671-1679.

[19]SILHA J V, KRSEK M, SKRHA J V, et al. Plasma resistin, adiponectin and leptin levels in lean and obese subjects: correlations with insulin resistance[J]. Eur J Endocrinol, 2003, 149(4): 331-335.

[20]DIEZ J J, IGLESIAS P. The role of the novel adipocyte-derived hormone adiponectin in human disease[J]. Eur J Endocrinol, 2003, 148(3): 293-300.

[21]UKKOLA O, SANTANIEMI M. Adiponectin: a link between excess adiposity and associated comorbidities[J]. J Mol Med, 2002, 80(11): 696-702.

[22]RENALDI O, PRAMONO B, SINORITA H, et al. Hypoadiponectinemia: a risk factor for metabolic syndrome[J]. Acta Med Indones, 2009, 41(1): 20-24.

Effect of n-3 PUFA-containing Diet on Obesity and Obesity-related Cell Factors in Mice

ZHENG Zheng，GE Yin-lin*，XUE Mei-lan，QIN Wei-wei，XU Yan-jun，HOU Lin
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

Objective: To determine the effect of n-3 PUFA diet on obesity and obesity-related cell factors in mice. Methods: A total of 36 healthy female mice were randomly divided into three groups: high fat diet group, n-3 PUFA-containing diet group and control group. Body weight and food intake were recorded once a weed during the trail period and the levels of serum adiponectin, orexin-A and resistin were determined by ELISA method at the end of the trial. Results: The adiposity and serum orexin-A level in the n-3 PUFA-containing diet group were significantly lower than that in the high fat diet model group (P ＜0.05), and the level of serum resistin in the n-3 PUFA-containing diet model group was significantly higher than that in the high fat diet model group (P ＜ 0.05). Conclusion: An obvious reduction on the development of adiposity was observed in mice fed n-3 PUFA-containing diet.

n-3 PUFA；obesity；adiponectin；orexin-A；resistin

R151.4

A

1002-6630(2010)19-0342-05

2010-02-11

鄭征(1982—)，男，碩士研究生，研究方向為基因治療。E-mail：rebelzheng@gmail.com

*通信作者：葛銀林(1957—)，男，教授，博士，研究方向為基因治療。E-mail：geyinlin@126.com