胡力飛,梅文莉,易克賢,戴好富

中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所農業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室,海口 571101

劍麻提取物的細胞毒活性研究

胡力飛,梅文莉,易克賢,戴好富＊

中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所農業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室,?？?571101

用溶劑萃取法對劍麻的 95%乙醇提取物進行分段處理,利用MTT法測定各提取部位的體外細胞毒活性。正丁醇提取物對腫瘤細胞株 K-562、S MMC-7721和 SGC-7901顯示有生長抑制活性,IC50值分別為 5.6、23.8和 26.8μg/mL,而石油醚、乙酸乙酯和水溶性部位則沒有活性。

劍麻;細胞毒活性;MTT法

劍麻 (Agave sisalanaPerrine)又名菠蘿花,為龍舌蘭科龍舌蘭屬植物,是亞熱帶特有的多年生草本經濟作物。原產墨西哥尤卡坦半島,我國海南、廣東、廣西、云南和福建等省均有種植。劍麻葉具有涼血止血、消腫止痛之功效,民間常用于治療肺癆咯血、衄血、便血、痢疾、癰瘡腫毒和痔瘡[1]。劍麻葉片含豐富的纖維,是重要的工業(yè)原料,在劍麻葉片抽取纖維后的葉汁中含有有甾體骨架的劍麻皂苷元(Tigogenin),是合成甾體激素類藥物的重要原料[2]。本實驗利用溶劑法對劍麻的乙醇提取物進行分段處理,并運用MTT法,選擇人慢性髓原白血病細胞株 K-562、人肝癌細胞株 S MMC-7721和人胃腺癌細胞株 SGC-7901為實驗細胞株,研究劍麻提取物對腫瘤細胞的體外增殖作用和劑量效應關系,為劍麻資源的進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用植物樣品采自廣東湛江,由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為劍麻 (Agave sisalanaPerrine),憑證標本(20080701),現(xiàn)存于中國熱帶農業(yè)科學院。

四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、MEM和平衡鹽溶液PBS(北京欣經科公司);絲裂霉素 C(kyowa Hakko kogyo Co.Ltd.)。CO2培養(yǎng)箱 (RSBiotech Ltd.);酶標儀 (BioTek Instruments,Inc.)。

人慢性髓原白血病細胞株 K-562、人肝癌細胞株 S MMC-7721和人胃腺癌細胞株 SGC-7901購自中國科學院細胞庫,在含有 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)基中,于 5%CO2、濕度 90%以上、37℃溫箱中培養(yǎng),貼壁細胞用 0.25%胰酶消化。

1.2 樣品的制備

取新鮮劍麻葉片 (10.5 kg),粉碎后用重蒸的95%工業(yè)乙醇冷浸提取 3次,提取液濃縮至無醇味后分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分別得到石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(E tOAc)、正丁醇提取物 (n-BuOH)和水提物 (H2O)。上述4種提取物均用于體外抗腫瘤活性篩選。

1.3 體外腫瘤細胞生長抑制實驗 (MTT法)[3]

實驗設陰性對照組 (DMSO溶劑對照組)、陽性對照組 (絲裂霉素C)和 5個不同濃度的待測樣品,每個濃度設 2個平行。

收集對數生長期細胞,血球計數板計數,按每孔4500個癌細胞量接種于 96孔平底細胞培養(yǎng)板中,置于 5%CO2、濕度 90%以上、37℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后取出加入一定量的待測樣品,繼續(xù)培養(yǎng) 3 d后取出置于顯微鏡下觀察每孔細胞形態(tài),記錄細胞形態(tài)變化情況,接著每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于平衡鹽溶液 PBS)50μL,37℃反應 4 h后,將細胞培養(yǎng)液吸出,每孔加入 100μL DMSO使For mazane充分溶解后,將細胞培養(yǎng)板置于 ELX-800酶標儀上,用 490 nm波長測各孔的吸光度 (A),按下列公式求生長抑制率。而后以樣品濃度為橫坐標,以抑制率為縱坐標,作圖并求出抑制率為 50%時樣品的濃度 (I C50),樣品活性結果即以半數抑制濃度 (IC50)表示。

2 結果與討論

以MTT法對劍麻的 4種提取物進行了體外腫瘤細胞毒活性篩選,結果見圖 1和表 1。從圖表中可以看出,石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(EtOAc)和水提物 (H2O)的篩選結果均為陰性;而正丁醇提取物 (n-BuOH)對體外培養(yǎng)的人慢性髓原性白血病細胞株 K-562、肝癌細胞株 S MMC-7721和胃癌細胞株 SGC-7901的增殖均顯示出抑制作用,在測定濃度范圍內呈現(xiàn)良好劑量依賴性,對人慢性髓原性白血病細胞株 K-562、肝癌細胞株S MMC-7721和胃癌細胞株 SGC-7901的 I C50值分別為 5.6μg/mL、23.8μg/mL和 26.8μg/mL。

圖 1 劍麻 n-BuOH提取物對腫瘤細胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of the n-BuOH extract fromA-gave sisalanaon tumer cell lines

表 1 劍麻提取物的 IC50值 (μg/mL)Table 1 The IC50values of extracts fromAgave sisalana(μg/ mL)

劍麻乙醇提取物的正丁醇部位的化學成分主要為高極性成分。據文獻報道,龍舌蘭屬植物中含大量的甾體皂苷元和甾體皂苷[4]。楊崇仁等從劍麻葉汁提取物的甲醇部分中分離得到 5個甾體皂苷dongnoside A、B、C、D、E[5,6],每個甾體皂苷的糖鏈含有 5個糖單位以上,糖鏈由葡萄糖,木糖,半乳糖和鼠李糖 4種單糖組成。劍麻中的抗腫瘤活性成分是否就是這些甾體皂苷,還有待進一步研究確證。

此外,我們通過薄層層析 (TLC)比較了劍麻及抽取纖維后麻渣的乙醇提取物的正丁醇部位的化學成分,發(fā)現(xiàn)二者所含化學成分基本一致。目前在廣東湛江地區(qū),抽取纖維后的麻渣均為廢棄物,既浪費了資源,又污染了環(huán)境。因此本次研究結果將為劍麻麻渣的開發(fā)利用提供科學依據。

1 Editorial Committee of Chinese Materia Medica.State Drug Administration of China.Chinese Materia Medica(中華本草).Shanghai:Science and Techonology Press,1999.7244.

2 Han YL(韓耀玲),Lin CW(林翠梧).Extraction and isolation of tigogenin.J Henan univ,M ed Sci(河南大學學報,醫(yī)學版),2006,25:27-29.

3 Mos mann T.Rapid color imetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Imm unolM ethods,1983,65:55-63.

4 Zhang YH(張援虎),Wang FP(王鋒鵬).Recent Advance of Chemical Constituents ofAgave SPP.Plants.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發(fā)),2003,15:349-353.

5 Ding Y,Tian RH,YangCR,et al.Two new steroidal saponins from dried fermented residuesof leaf-juices ofAgave sisalanaforma dongNo.1.Chem Phar m Bull,1993,41:557-560.

6 Ding Y,Chen YY,WangDZ,et al.Steroidal saponins from a cultivated form ofAgave sisalana.Phytochem istry,1989,28: 2787-2791.

Cytotoxic Activity ofAgave sisalanaExtract

HU Li-fei,MEIWen-li,YI Ke-xian,DA IHao-fu＊
Key Laboratory of Tropical Crop B iotechnology,M inistry of Agriculture,Institute of Tropical B ioscience and B iotechnology,Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China

The 95%ethnol extract fromAgave sisalanawas treated by solvent partition to afford different extracts.The cytotoxic activities of the different extractsin vitrowere evaluated byMTTmethod.Then-butanol extract showed inhibitory effect on the cell linesof K-562,S MMC-7721 and SGC-7901 with the I C50valuesof 5.6,23.8 and 26.8μg/mL,respectively.The extract of petroleum ether,ethyl acetate and water-soluble showed no activity.

Agave sisalanaPerrine;cytotoxic activity;MTTmethod

R284.2;R285

A

1001-6880(2010)05-0907-02

2009-08-13 接受日期:2009-11-03

973計劃前期研究專項 (2007CB116306)

＊通訊作者 Tel:86-898-66988061;E-mail:hfdai2001@yahoo.com.cn