孫 濤,銀旭紅,甘建紅,賴克強(qiáng),周冬香

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306

不同取代度N-馬來酰低聚殼聚糖的抗氧化活性的研究

孫 濤＊,銀旭紅,甘建紅,賴克強(qiáng),周冬香

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306

低聚殼聚糖(COS)酰化得到三種取代度(DS)不同的N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC,其 DS分別為 0.25、0.67和 0.89。對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行紅外表征。并考察了 NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC對(duì)羥基自由基(·OH)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)的清除活性以及還原能力。結(jié)果表明:N-馬來酰衍生物有明顯的抗氧化活性,隨著取代度的升高,N-馬來酰衍生物清除 DPPH的能力以及還原能力增強(qiáng),即NMCOSC＞NMCOSB＞NMCOSA;清除·OH的活性順序?yàn)镹MCOSB＞NMCOSA＞NMCOSC,即取代度為0.67的表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性。這可能與氨基和羥基的數(shù)目、取代基團(tuán)的性質(zhì)以及清除自由基的機(jī)理不同有關(guān)。

低聚殼聚糖;N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物;取代度;抗氧化

自由基是獨(dú)立存在的帶有未成對(duì)電子的原子或基團(tuán)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基過多時(shí),它可以通過氧化作用攻擊生物大分子,產(chǎn)生氧化損傷,從而引起蛋白質(zhì)損傷、酶失活、膜質(zhì)過氧化等,導(dǎo)致疾病,加速衰老[1-3]。因此尋找能清除自由基的天然抗氧化劑有著重要的意義。

隨著對(duì)多酚和黃酮類物質(zhì)抗氧化作用的深入研究,天然多糖的抗氧化作用也日益受到廣泛的關(guān)注[4,5]。甲殼素是自然界儲(chǔ)量極為豐富的可再生天然多糖,其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖由于分子量大,結(jié)構(gòu)緊密,水溶性差,應(yīng)用受到限制。而低聚殼聚糖分子量低,水溶性好,理化性質(zhì)均得以改善[6]。近年來,低聚殼聚糖及其衍生物的抗氧化性日益受到關(guān)注[7]。研究表明,低聚殼聚糖醚化衍生物,季銨鹽衍生物都有明顯的抗氧化活性[8,9]。但是對(duì)低聚殼聚糖?；苌锏目寡趸钚陨形从醒芯繄?bào)道。本文通過對(duì)低聚殼聚糖進(jìn)行?；?制備了不同取代度的N-馬來酰低聚殼聚糖,并研究了其抗氧化活性,為低聚殼聚糖的化學(xué)改性進(jìn)一步研究及其產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

低聚殼聚糖,購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司(凝膠色譜測(cè)定其分子量為 5000 Da);魯米諾,DPPH,購自 Sigma公司;其余試劑均為分析純。

磁力攪拌器;pH計(jì);分光光度計(jì);EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀;流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(IFF M-D,中國西安制造)。

1.2N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物的制備及表征

稱取 5.0 g低聚殼聚糖加入 100.0 mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙?稱取一定量的馬來酸酐,用 20.0 mL丙酮溶解,然后緩慢加入反應(yīng)器,在室溫下攪拌反應(yīng) 15 h,然后用丙酮沉淀,過濾,產(chǎn)物用丙酮反復(fù)洗滌,最后在 60℃烘干,得到N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物[10]。

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行,采用 KBr壓片法制樣,測(cè)定波數(shù)范圍為500～4000 cm-1,分辨率為 0.8 cm-1。

1.3 取代度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量N-馬來酰低聚殼聚糖 0.1000 g置500 mL燒杯內(nèi),準(zhǔn)確加入 0.1038 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 20.00 mL溶解樣品,再加入去離子水 200 mL稀釋、混勻,用 0.4685 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液返滴,測(cè)定電導(dǎo)率值。做電導(dǎo)率-氫氧化鈉體積關(guān)系圖,添加趨勢(shì)線,求其回歸方程,從而計(jì)算N-馬來酰低聚殼聚糖的取代度[11]。

1.4 DPPH自由基的清除

在裝有 2 mL的濃度為 1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液的比色管中,加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL,搖勻,33℃避光靜置半小時(shí),在 517 nm處測(cè)量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液,得吸光度A0,無水乙醇代替 DPPH,得吸光度 Aj。清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%[12]。

1.5 還原能力的測(cè)定

還原能力根據(jù)文獻(xiàn)測(cè)定并稍做改進(jìn)[13]。取2.0 mL不同濃度的樣品,加入 pH=6.60的 0.2 mol/L磷酸緩沖液 1%及鐵氰化鉀溶液各 2.5 mL,混勻,50℃水浴 20 min后迅速冷卻,加入 2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后在 3000 r/min下離心 10 min,取上清液 2.0 mL,加入 2.5 mL去離子水和 0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,靜置十分鐘后在 700 nm處測(cè)定吸光度,高吸光度表明高還原能力。

1.6 羥基自由基·OH的清除

用 pH=7.40的 0.05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液分別配制濃度為 6.4×10-4mol/L的魯米諾溶液、0.012 mol/L H2O2和 0.8 mg/mL亞鐵氰化鉀溶液。以緩沖液作為溶劑,配制成系列不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液,讀出峰面積。清除率 =(A0-Ai)/A0×100%。式中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經(jīng) SOD,過氧化氫酶及甘露醇檢測(cè),該體系產(chǎn)生的自由基為羥基自由基·OH[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

圖1 COS、NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of COS、NMCOSA、NMCOSB and NMCOSC

圖 1是 COS以及其N-馬來酰衍生物的紅外光譜圖。四種物質(zhì)在 3400,1560,1155,1071,1030,894 cm-1附近都有強(qiáng)吸收峰,其中 3400 cm-1附近的吸收峰是殼聚糖分子中的-NH2與-OH的伸縮振動(dòng)合并峰;1560 cm-1是酰胺Ⅱ的吸收峰;1157 cm-1附近及894 cm-1附近的吸收峰是殼聚糖的β-(1,4)糖苷鍵的特征吸收峰。1073 cm-1和 1023 cm-1處分別是 C3仲羥基和 C6伯羥基的 C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰[18]。

與低聚殼聚糖相比,N-馬來酰低聚殼聚糖有以下幾點(diǎn)變化:(1)3400 cm-1附近的吸收峰發(fā)生馬來?；笞冋?且取代度越高越向低波數(shù)方向位移,這由于低聚殼聚糖中-NH2被馬來酸酐取代,-NH2數(shù)目減少;(2)1630 cm-1附近出現(xiàn)為共軛烯烴的 C=C振動(dòng)吸收峰,且取代度越大,吸收峰越強(qiáng);(3)1707 cm-1附近出現(xiàn)為不飽和羧基因共軛作用的 C=O振動(dòng)吸收峰;(4)860 cm-1附近為雙建中 C-H面外振動(dòng)吸收峰,在低聚殼聚糖中未見此吸收峰。這些吸收峰證實(shí)了衍生物中馬來酸酐的存在[10]。而衍生物中 1073 cm-1和 1023 cm-1處的 C3仲羥基和 C6伯羥基的 C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰與低聚殼聚糖相比沒有明顯變化,說明衍生物是發(fā)生-N位馬來?；Ｓ秒妼?dǎo)滴定法測(cè)得NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC的取代度分別為 0.25、0.67和 0.89。

2.2 DPPH的清除活性

圖2 COS A、NMCOS B和NMCOSC對(duì)DPPH自由基的清除Fig.2 Scavenging effect of NMCOSA、NMCOSB and NMCOSC on DPPH radical

DPPH體系是一種廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化劑自由基清除能力的方法。其主要原理為DPPH接受自由基清除劑提供的電子或氫從而形成穩(wěn)定分子。圖 2是N-馬來酰衍生物清除 DPPH的曲線圖。所有樣品對(duì)DPPH的清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC對(duì)DPPH的半抑制濃度 I C50(清除率達(dá)到 50%時(shí)所需自由基清除劑的濃度)依次是 0.70、0.64和 0.54 mg/mL。N-馬來酰衍生物清除DPPH的活性大小次序依次為NMCOSC＞NMCOSB＞NMCOSA,即取代度升高,清除DPPH的活性增強(qiáng)。

2.3 還原能力

圖3 NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC的還原能力Fig.3 Reducing power of NMCOSA、NMCOSB and NMCOSC

還原能力和抗氧化活性之間有著密切的關(guān)系[15]?？寡趸镔|(zhì)通過提供電子可阻斷 Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)出一定的還原能力,同樣也可以通過提供電子和自由基反應(yīng),表現(xiàn)出抗氧化活性。

圖 3是N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物的還原能力曲線圖。由圖可以看出,隨著濃度的升高,所有樣品的還原能力增強(qiáng)。在濃度為 2.5 mg/mL時(shí), NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC的吸光值依次是: 0.48、0.54和 0.56。N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物的還原能力隨著取代度的升高而增強(qiáng),即NMCOSC＞NMCOSB＞NMCOSA。

2.4 羥基的清除活性

圖4 NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC對(duì)羥基自由基的清除Fig.4 Scavengingeffects of NMCOSA、NMCOSB and NMCOSC on hydroxyl radical

圖 4是N-馬來酰衍生物對(duì)羥基自由基·OH的清除能力曲線圖。從圖上可以看出,隨著樣品濃度升高,NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC對(duì)·OH的清除能力逐漸增強(qiáng)。NMCOSA、NMCOSB和NMCOSC對(duì)·OH的半抑制濃度 IC50分別為 0.42、0.32和0.57 mg/mL。他們清除·OH的活性順序依次是NMCOSB＞NMCOSA＞NMCOSC。三種N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物中,取代度為 0.67的 NMCOSB表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性。

N-馬來酰低聚殼聚糖衍生物的對(duì)自由基的清除能力及還原能力均受到下面幾個(gè)因素的影響:(1)氨基和羥基的數(shù)目。在N-馬來酰低聚殼聚糖中,部分氨基被馬來酸酐取代,與 COS相比,氨基數(shù)目減少;使抗氧化活性下降。(2)取代基團(tuán)的性質(zhì)。低聚殼聚糖引入馬來?；?COCH2=CH2COO-是吸電子基團(tuán),吸電子基團(tuán)對(duì)于自由基的清除起著雙重作用。一方面,它能降低 COS分子中電子云密度,從而降低了分子內(nèi)、分子間的成鍵幾率,釋放出更多的氨基和羥基與自由基反應(yīng);同時(shí),也會(huì)使N-H和OH鍵更易斷裂,使氨基和羥基的活性提高,從而有利于清除自由基。(3)-COCH2=CH2COO-會(huì)增加氨基和羥基與自由基反應(yīng)的空間位阻,從而不利于清除自由基。此外,不同的反應(yīng)機(jī)理也會(huì)影響N-馬來酰殼聚糖的抗氧化活性。

當(dāng)取代度從 0.25上升到 0.67,繼而上升到0.89時(shí),N-馬來酰低聚殼聚糖對(duì)DPPH的清除活性依次增強(qiáng),這可能是由于隨著取代度的增大,盡管氨基數(shù)目減少,但-COCH2=CH2COO-吸電子作用占主導(dǎo)地位。且DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基,因此受空間位阻的影響不大,故對(duì) DPPH的清除能力隨取代度的上升而增強(qiáng)。同樣,還原能力主要受-COCH2=CH2COO-吸電子作用的影響,故表現(xiàn)出與 DPPH相同的規(guī)律。而·OH是一種非?；畈ǖ淖杂苫?它對(duì)空間位阻很敏感。在對(duì)·OH的清除過程中,當(dāng)取代度從 0.25升高到 0.67,-COCH2=CH2COO-吸電子作用占主導(dǎo)地位,故對(duì)·OH的清除能力增大,即NMCOSB＞NMCOSA;當(dāng)取代度繼續(xù)升高至0.89時(shí),氨基數(shù)目的下降和空間位阻的增加占主導(dǎo)地位,故對(duì) ·OH的清除能力急劇下降,導(dǎo)致NMCOSC＜NMCOSA.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)低聚殼聚糖進(jìn)行?；?制備了三種不同取代度的N-馬來酰低聚殼聚糖,并考察了其抗氧化活性。結(jié)果表明:隨著取代度的增加,N-馬來酰低聚殼聚糖清除 DPPH的活性以及還原能力增強(qiáng);而清除羥基的活性的順序依次為:NMCOSB＞NMCOSA＞NMCOSC,其中取代度為 0.67的NMCOSB表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性。這可能與氨基和羥基的數(shù)目、取代基團(tuán)的性質(zhì)以及清除不同自由基的機(jī)理不同所致。本實(shí)驗(yàn)對(duì)殼聚糖衍生物的開發(fā)為尋找和應(yīng)用天然抗氧化劑提供了新的思路。

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Antioxidant Activity ofN-Maleoyl Chitosan O ligosaccharide with D ifferent Substituting Degrees

SUN Tao＊,YIN Xu-hong,GAN Jian-hong,LA I Ke-qiang,ZHOU Dong-xiang
College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China

N-maleoyl chitosan oligosaccharides(NMCOSA,NMCOSB and NMCOSC)with different substituting degrees (DS were 0.25,0.67 and 0.89,respectively)were prepared by chemical modification of chitosan oligosaccharide (COS).The chemical structures of the chitosan oligosaccharides derivatives were characterized by FTIR.Their antioxidant activitieswere evaluated by the scavengingof hydroxyl radical(·OH),1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl(DPPH)and reducing power.The results indicated that theN-maleoyl chitosan oligosaccharides derivatives have obvious antioxidant activity,the scavenging effects on DPPH and the reducing powerwere all increased with the increasing of the substituting degree:the orders of their scavenging effects on·OH wasNMCOSB＞NMCOSA＞NMCOSC,the NMCOSB showed the best scavenging effects on·OH.That may be related with the number of the amino and hydroxyl groups,the properties of the substituting groups and the different scavenging mechanis ms against free radicals.

chitosan oligosaccharide;N-maleoyl chitosan oligosaccharide;substituting degree;antioxidant

Q946.91;R285;TS202.3

A

1001-6880(2010)05-0890-04

2009-04-30 接受日期:2009-06-17

上海市教育委員會(huì)科研項(xiàng)目 (07zz134);上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目專項(xiàng)基金 (J50704)

＊通訊作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn