孫 菁,李法強,徐文華,陳桂琛＊

1中國科學院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,西寧 810001;2中國科學院青海鹽湖研究所,西寧 810008

傳統(tǒng)中藏藥材小秦艽中 20種氨基酸的測定

孫 菁1,李法強2,徐文華1,陳桂琛1＊

1中國科學院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,西寧 810001;2中國科學院青海鹽湖研究所,西寧 810008

以 1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)作為柱前衍生化試劑,采用梯度洗脫實現了傳統(tǒng)中藏藥材小秦艽中 20種氨基酸衍生物的基線分離,利用電噴霧離子源 (ESI Source)正離子模式,實現了小秦艽中氨基酸的定性測定,可為秦艽類藥用植物資源化學成分的深入開發(fā)利用提供依據。結果表明,所建立的方法線性范圍寬、重復性較好,大多數氨基酸衍生物的線性回歸系數大于 0.9990,檢測限為 6.5～178.2 fmol。小秦艽中氨基酸組成豐富,至少含有 18種氨基酸和 7種人體必需氨基酸,營養(yǎng)價值較高。同一氨基酸成分在不同采樣點表現出不同含量,體現了小秦艽該類成分的地理分布差異特征。氨基酸成分與生態(tài)環(huán)境的相關分析結果顯示只有緯度與Lys之間達到了極顯著的負相關關系,其余各因子之間均未達到顯著水平,說明緯度對小秦艽氨基酸含量有較大的影響。

小秦艽;BCEOC;氨基酸;生態(tài)環(huán)境

小秦艽 (Gentiana dahuricaFischer)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬多年生草本,是我國著名的傳統(tǒng)中藏藥材,收載于 2005版《中國藥典》[1]和藏藥志中[2]。其生于海拔 800～4500 m的草原陽坡、河谷階地等生境下,在我國主要分布于四川北部及西北部、西北、華北、東北等地區(qū)[3];以干燥根入藥,可用于治療扁桃體炎、蕁麻疹、風濕性關節(jié)炎等癥[1,2]。目前,對小秦艽的研究主要集中在其 rRNA序列的分析[4]、龍膽苦苷含量的測定[5]以及化學成分的分析上[6],有關其氨基酸含量的測定尚未見報道。氨基酸是廣泛分布于動植物體內的有機氮化合物,是構成生物體的蛋白質的重要組成,在生物體內發(fā)揮著重要的生理生化作用[7,8],同時也是許多中藥藥用價值的評價標準之一[9-11]。因此,本文采用新型高靈敏度熒光試劑 1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)[12]作為柱前衍生化試劑,室溫下在乙腈溶劑中以硼酸鈉緩沖溶液控制反應體系的 pH=9.0,10 min即可衍生完全。衍生物穩(wěn)定性好,衍生產率高,衍生溶液不必預處理可直接進樣分析。在乙腈/水作流動相的條件下,采用梯度洗脫達到了 20種氨基酸衍生物的完全基線分離,實現了小秦艽根部氨基酸的快速、準確分析,可為秦艽類藥用植物的治病機理、合理用藥以及深入開發(fā)利用提供一定的理論依據。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

小秦艽根部采自青海省 8個不同地方 (表 1),以 GPS記錄海拔和經緯度。采集后,混勻去除雜土等,自然狀態(tài)下風干,粉碎,過 100目篩,待分析用。

表 1 采樣點生態(tài)環(huán)境調查數據Table 1 Ecological environmental data of sampling localities

1.2 儀器與試劑

Agilent1100型高效液相色譜 -質譜聯用儀(Agilent公司)配備四元梯度泵,在線真空脫氣機,熒光檢測器 (Fluorescence Detector),100位自動進樣器,電噴霧電離源 (Electrospray Ionization Source, ESI Source),HypersilBDS C18色譜柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,大連依立特公司)。BCEOC由山東曲阜師范大學尤進茂教授實驗室合成,氨基酸標準樣品 (Sigma公司),色譜純乙腈(禹城化學試劑廠),其它試劑均為分析純,純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

圖1 BCEOC與氨基酸衍生反應概況Fig.1 Derivatization scheme ofBCEOC with amino acids

1.3 標準溶液的配制

準確稱取定量氨基酸標準品,加入少量 6 mol/L的鹽酸溶解后用 6 mol/L的氫氧化鈉溶液調至中性,然后用 pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液定容配成1.0×10-2mol/L的溶液,相應低濃度氨基酸標準液(5.0×10-4mol/L)以色譜純乙腈稀釋而成。稱取32.6 mgBCEOC,用無水乙腈溶解并定容至 10 mL,其濃度為 1.0×10-2mol/L。低濃度的衍生試劑 (1.0 ×10-3mol/L)用無水乙腈稀釋而成。

1.4 氨基酸標準品的衍生過程

向 1.5 mL安培瓶中依次加入 160μL乙腈,300 μL硼酸鈉緩沖溶液 (pH=9.0),15μL混合氨基酸,60μL衍生試劑溶液,于 30℃至 40℃水浴中反應 10 min,加入 10μL 30%的乙酸溶液調至弱酸性后即可直接進樣分析。衍生反應概況如圖 1。

1.5 樣品的制備

參照文獻[13]方法進行:稱取約 100 mg粉碎后的樣品,置于 1.5 mL安培瓶中,加入 6 mol/L鹽酸溶液 1mL,密封后在 110℃水解 24 h,過濾,用N2吹干后用 1 mL pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液溶解,定容到 10 mL容量瓶中,相應濃度為 1000 ng/μL。低濃度的水解溶液(10 ng/μL)用 pH=9.0的硼酸鈉緩沖溶液稀釋而成。

1.6 色譜及質譜條件

色譜柱:HypersilBDS C18色譜柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,)。流動相 A:30%乙腈水溶液 (含有 30 mmol/L的甲酸,用氨水調至 pH=3.7),B: 50%的乙腈,C:95%的乙腈。流速為 1.0 mL/min,進樣量為 10μL,柱溫 30℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為:λex=333 nm,λem =390 nm。梯度洗脫程序見表 2。

電噴霧離子源 (ESI Source)正離子模式 (positive ion mode),噴霧壓力為 241.32 kPa,干燥氣流量為 9 L/min,干燥氣溫度 350℃,毛細管電壓3500V[14,15]。

表 2 梯度洗脫程序Table 2 Chromatographic gradient conditions eluted on HypersilBDS C18column

2 結果

2.1 標準品的色譜分離及質譜鑒定

按照標準品的衍生過程進行衍生后,在 HypersilBDS C18色譜柱上以乙腈/水作流動相,采用梯度洗脫在 65 min內實現了 20種氨基酸衍生物的完全分離,結果見圖 2,所有衍生物均可獲得較好的基線分離。各分析組分的定性采用電噴霧電離源(ESI Source)進行在線的柱后質譜鑒定,質譜數據見表 3。

2.2 線性回歸方程、檢測限及回收率

不同濃度的氨基酸標準品溶液分別進樣 10 μL,標品的進樣量在 105.6 pmol～51.6 fmol范圍內,依據各氨基酸衍生物的峰面積和進樣量進行線性回歸,所得回歸方程﹑相關系數和各種氨基酸衍生物檢測限見表 3。各氨基酸衍生物的線性相關系數均在 0.9990以上,檢測限在 6.5～178.2 fmol之間 (按 S/n=3:1計算)。在制備得到的小秦艽根部水解氨基酸樣品中加入一定量的氨基酸標準品后,按照上述衍生化條件和色譜分離條件進行分析測定,所得 20種氨基酸衍生物的回收率均大于 93%。在相同洗脫條件下,對 53 pmol氨基酸衍生物進行六次平行測定,保留時間相對標準偏差 RSD小于0.05%,峰面積相對標準偏差 RSD小于 2.3%,各種氨基酸衍生物保留時間和峰面積的重現性見表 3。

2.3 樣品的色譜分離和含量測定

按照 1.6項下色譜分離條件,對制備后的樣品分析其水解氨基酸,色譜分離圖見圖 3,含量測定結果見表 4。

圖 2 20種氨基酸標準品的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of twenty amino acid standards derivatized with BCEOC

表 3 20種氨基酸衍生物的線性回歸方程及相關指標(n=6)Table 3 Linear regression equations,and correlation index of 20 amino acid derivatives(n=6)

圖 3 小秦艽樣品中水解氨基酸代表性色譜分離圖Fig.3 Chromatographic separation of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricasamples

2.4 氨基酸類成分與生態(tài)環(huán)境的相關分析

利用 SPSS統(tǒng)計軟件中的相關分析方法對小秦艽中氨基酸類成分與生態(tài)環(huán)境的相關性進行分析(表 5),結果表明只有緯度與 Lys之間達到了極顯著的負相關關系 (P＜0.01),即緯度越高,Lys的含量越低;其余各因子之間均未達到顯著水平。

3 討論

表 4 小秦艽根部水解氨基酸含量(mg/g,n=3)Table 4 Contents of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricaroots(mg/g,n=3)

BCEOC試劑對氨基酸的測定具有較高的靈敏度[12],此方法能夠準確定量且具有線性范圍寬、重

注:“-”表示未檢出。下同。Note:“-”refers to undetected.

表 5 小秦艽氨基酸與生態(tài)環(huán)境相關分析Table 5 Correlation coefficient matrix between amino acids inG.dahuricaand ecological environments

注:0.01水平時相關系顯著。Note:＊＊Correlation coefficient is significant at the level of 0.01(2-tailed).

現性好等優(yōu)點,在氨基酸的分析研究中具有重要的作用。應用于小秦艽氨基酸含量的測定,取得了較好的效果。

在所測定的 20種氨基酸中,小秦艽藥用部位富含 18種氨基酸,氨基酸種類較豐富,其含量測定結果與另一藏藥波棱瓜的結果近似[11],其中包括 7種人體必需的氨基酸 (Thr,Val,Ile,Leu,Phe,Try, Lys),占氨基酸總量的 24.78%,有較高的營養(yǎng)價值。必需氨基酸的缺乏可減低體液的免疫反應,如Try能夠維持正常的抗體生成,Phe缺乏使抗體不能發(fā)生正常的反應。必需氨基酸的缺乏,還可引起抗體合成的障礙。因此,氨基酸既可作為營養(yǎng)成分,提供或補充生命體的生命活動所需,又可用來防治多種疾病。其中Arg,Asp和 Glu對于治療肝膽類疾病有直接的作用效果[16],小秦艽中 Asp平均含量較高(3.333 mg/g),其具有的藥理生物活性是否與上述氨基酸組成和含量有關尚需進一步藥理研究證明。

由表 4可以看出,同一氨基酸成分在不同采樣點含量不同,以含量較高的Asp為例,其最高含量達到 10.377 mg/g,最低含量則為 0.806 mg/g,相差 12倍之多。顯示出小秦艽氨基酸類成分的地理分布差異特征。氨基酸類成分與環(huán)境因子的相關分析結果顯示,緯度越高,即越往北的地方,小秦艽中 Lys含量越低?？梢?緯度是影響小秦艽中氨基酸含量的首要因子。同時也表明,環(huán)境是決定藥用植物化學成分的一個重要因素[17]。

致謝:本研究中衍生試劑 BCEOC由山東曲阜師范大學尤進茂教授實驗室贈送,實驗過程中得到了趙先恩等同學的熱誠幫助,在此一并表示感謝。

1 Pharmacopoeia of P.R.China,Vol.1(中華人民共和國藥典(一部)).Beijing:Chemical Industry Press,2005.210.

2 Yang YC(楊永昌).Tibetan Medicines(藏藥志).Xining: Xining People’s Press,1991.11.

3 Ho TN,Liu S W.A worldwide monograph of Gentiana.Beijing:Science Press,2001.174-175.

4 Ji KP(姬可平),Zhang XL(張西玲),Liu LS(劉麗莎),et al.Primary study on measuring the internal transcribed spacer I regions of rRNA genein seeds ofGentiana dahurica.China J Chin M atM ed(中國中藥雜志),2003,28:313-316.

5 Ni H(倪慧),MakhabelB(波拉提·馬卡比力),Qing DG (卿德剛),et al.Determination and comparison of gentiopicroside of various parts of five species of genus Gentiana collected from Xinjiang by TLCS.J Chin M ed M at(中藥材), 2004,27:500-501.

6 Yang J(楊婕),Ma J(馬驥),Zhou DX(周東星),et al. Study on the chemical constituents ofGentiana dahurica.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥),2006,37:187-189.

7 Aslam M,Travis RL,Rains DW.Differential effect of amino acids on nitrate uptake and reduction systems in barley roots.Plant Sci,2001,160:219-228.

8 Li XZ,Larson DE,Glibetic M,et al.Effect of glutamine on the induction of nitrate reductase.Physiol Plantarum,1995, 93:740-744.

9 WangDG(王德貴),Yao HY(姚惠英),Su Z W(蘇中武).Analyses on the amino acids and trace elements of 3 species of Prunella.J Plant Resources and Environ(植物資源與環(huán)境學報),1994,3(4):61-62.

10 Hong YL(洪燕龍),Du SY(杜守穎),Yang G(楊剛),et al.瓜蔞皮藥材及其注射液中總氨基酸的含量測定方法研究.Chin J Experim TraditM ed For m ulae(中國實驗方劑學雜志),2004,10(3):10-12.

11 Li YL(李玉林),Zhou CF(周昌范),Wang HL(王洪倫),et al.Analysis of amino acids in TibetanMedicine Herpetospermum penduculosum.Am ino Acids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),2005,27(4):11-12.

12 You JM,Ming YF,Shi Y W,et al.Development of a sensitive fluorescence derivatization reagent 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chloroformate(BCEOC)and its application for deter mination of amino acids from seeds and bryophyte plants using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection and identification with electrospray ionization mass spectrometry.Talanta,2005,68:448-458.

13 WeissM,MannebergM,Juranville JF,et al.Effect of the hydrolysismethod on the determination of the amino acid composition of proteins.J Chrom atogrA,1998,795:263-275.

14 Ndjoko K,Wolfender JL,Hostettmann K,et al.Determination of trace amounts of ginkgolic acids in Ginkgo biloba L.leaf extracts and phytophar maceuticals by liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry.J Chrom atogr B,2000,744: 249-255.

15 Friso S,Choi S W,Dolnikowski GG,et al.A method to assess genomic DNA methylation using high-perfor manceliquid chromatography/electrospray ionizationmass spectrometry.A-nal Chem,2002,74:4526-4531.

16 Yu CL(余傳隆).氨基酸與人類健康.Am inoAcids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),1999,21(4):4-8.

17 Tao SH(陶曙紅),Wu FE(吳鳳鍔).Effect of ecological environment on active constituents of medicinal plants.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發(fā)),2003,15:174-177.

Determ ination of 20 Hydrolytic Am ino Acids in an Important Tibetan and Chinese M edicineGentiana dahurica

SUN Jing1,L I Fa-qiang2,XU Wen-hua1,CHEN Gui-chen1＊

1Q inghai Key Laboratory of Q inghai-Tibet Plateau B iological Resources,Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academ y of Sciences,Xining 810001,China;2Q inghai Institute of Salt Lakes,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China

A s imple and sensitive method for the determination of 20 amino acids in an important Chinese and Tibetan medicineGentiana dahuricausing pre-column derivatization-reversed phase HPLC with fluorescence detection and mass spectrometric identification was developed.1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chlorofor mate(BCEOC)was used as the fluorescence derivatization reagent.20 amino acid derivativeswere separated on a HypersilBDS C18columnwith a good baseline resolution and detected with the fluorescence of which excitation and emission wavelengths of derivatives were set at 333 and 390 nm,respectively.Experimental results indicated that the established method had good repeatability and the correlation coefficients for the amino acids derivatization were＞0.9990.The detection limit range(at single-to-noise of 3:1)was 6.5-178.2 fmol.The identification of amino acid derivatives from hydrolyzedG.dahuricawas obtained on the basis of ESI detection atpositivemode.The composition of amino acids inG.dahuricawas abundant and showed higher nutritional value,ofwhich there were 18 amino acids and 7 necessary amino acids for the health of people.The same amino acid had different concentration level in different sampling locality and presented the characteristics of geographical differentiation.Correlation coefficient matrix be tween amino acids and ecological environments showed that there was no significance among the rest factors except that latitude had a significant negative correlation relationship with Lys at the level of 0.01.Thus,at the present study,the ecological environment,especially the latitude, was one of the important factors influencing the chemical constituents of herbalmedicines.The established method could be used and provided reference for the further development and utilization ofGentianaspecies.

Gentiana dahuricaFischer;BCEOC;amino acids;ecological environments

R917;R927.2;Q948.11

A

1001-6880(2010)05-0840-06

2008-12-02 接受日期:2009-03-30

國家中西部專項(2001BA901A47)項目

＊通訊作者 Tel:86-971-6143900;E-mail:gcchen@nwipb.ac.cn