謝娟平,孫文基

1安康學院化學化工系,安康 725000;2西北大學陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室,西安 710069

梯度洗脫法同時快速分離測定不同品種不同部位淫羊藿中 7種異戊烯基黃酮類成分的研究

謝娟平1＊,孫文基2

1安康學院化學化工系,安康 725000;2西北大學陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室,西安 710069

建立一種同時快速分離測定不同品種、不同部位淫羊藿中雙藿苷 A、淫羊藿屬苷 A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素 7種異戊烯基黃酮類成分的梯度洗脫方法,其中雙藿苷A、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素為首次報道其含量測定。實驗比較了三種不同的梯度洗脫條件和三種不同的提取分離條件,選出了實驗的最佳條件:采用RP-HPLC法,以美國WATERS SUNFIRET M-C18為色譜柱,乙腈-水為流動相,梯度洗脫 (乙腈:0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%),流速為 1 mL/min,檢測波長 270 nm,在此條件下,30 min內(nèi)所有組分均得到了良好的分離。實驗同時考察比較了巫山淫羊藿植株不同藥材部位和其它十種不同品種淫羊藿中 7種異戊烯基黃酮類成分的分布。結果表明:不同品種淫羊藿中黃酮類成分的含量差異很大,但大部分品種以朝藿定 C為主;同一品種巫山淫羊藿不同部位中則雙藿苷A和朝藿定 C的含量較大 (在巫山淫羊藿根中,兩者的含量分別為現(xiàn)行質量控制指標淫羊藿苷的 20倍和 30倍),可見巫山淫羊藿顯著不同于其它品種的淫羊藿,朝藿定 C在其藥用效果中可能比淫羊藿苷扮演著更重要的角色尤其是在根部作為藥用時,這也為民間將巫山淫羊藿根作為小黃連使用提供了一定的實驗支持。結論:對于品種較多,分布資源較廣的淫羊藿藥材,作為藥用時,應注意品種和藥用部位,考察藥材的內(nèi)在質量,不能一概而論。實驗所得到的方法能被用做淫羊藿植株中二次代謝產(chǎn)物分布的快速考察、篩選符合要求的淫羊藿原藥材和淫羊藿制備藥物中的質量考察。

淫羊藿;異戊烯基黃酮;分離;定量測定;RP-HPLC

淫羊藿為小檗科常用中草藥,具有補腎陽、強筋骨、怯風濕的功能[1-3],在中國藥用已超過 2000年的歷史,廣泛用于治療心血管疾病和其他慢性疾病。中國淫羊藿資源相當豐富,常用品種為朝鮮淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、柔毛淫羊藿、淫羊藿等,常用其植株的干燥地上部分,尤其是巫山淫羊藿根在民間作為“小黃蓮”來使用,具有較高的臨床價值。該屬其它植物在個別地區(qū)也作淫羊藿用,稱習用淫羊藿藥材?，F(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿對骨質疏松癥有強烈活性[4]。

淫羊藿藥材含有多種黃酮類成分[1,5],主要是異戊烯基黃酮,形成了該屬獨特的黃酮類成分。提取分離實驗表明,淫羊藿中主要含有七種黃酮類成分,包括雙藿苷 A、淫羊藿屬苷A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素。其中以淫羊藿苷為代表的 HPLC法含量測定已有許多報道[5,6],中國藥典也以淫羊藿苷作為特征性成分規(guī)定了含量測定,限度不低于 0.5%[7],但對于淫羊藿藥材中七種異戊烯基黃酮成分含量的同時分離與快速測定則未見報道,尤其是雙藿苷 A、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素的含量測定未見報道。特別是巫山淫羊藿根中的化學成分,在以前的報道中,淫羊藿苷是提取物中的主要有效部分。我們從巫山淫羊藿根中分離到上述七種異戊烯基黃酮,其中巫山淫羊藿根中以雙藿苷A和朝藿定 C為主,葉中以朝藿定 C和淫羊藿苷為主;不同品種淫羊藿葉中黃酮類成分的含量差異很大,但大部分品種以朝藿定 C為主。此外上述七種異戊烯基黃酮均顯示了一定的抗氧化活性和抗菌活性,其中淫羊藿屬苷 C和多甲基羥基淫羊藿素的抗氧化活性強于其它黃酮[8],這也為民間將巫山淫羊藿根作為“小黃連”使用提供了一定的理論支持。因此,測定淫羊藿中黃酮類成分的含量對評價其質量和控制臨床研究劑量是必須的。

本研究建立了一種簡單有效的 RP-HPLC方法。可用于同時分離分析淫羊藿中七種黃酮類成分,用此方法對采集的不同品種的淫羊藿和同一品種淫羊藿藥材不同部位中的七種黃酮類成分進行了快速分離分析考察,結果良好。

1 儀器與試劑

WATERS高效液相色譜儀,包括 2695泵,2487紫外檢測器,Empower色譜工作站;微孔濾膜φ=13 mm,4.5μm(天津市色譜科學技術公司)。

乙腈為色譜純,水為雙蒸水并經(jīng) 0.45μm水系濾膜過濾。對照品均為自行分離精制,并經(jīng) UV、I R、FAB-MS、HAMR、CNMR鑒定結構,HPLC檢測,面積歸一化法計算純度,均大于 98%(圖 2)。

不同品種淫羊藿植物樣品由洛陽陸生植物研究所王忠東教授鑒定并提供;兩年生巫山淫羊藿由陜西省安康市藥品檢驗所胥道寶主任藥師鑒定并提供。

2 方法

2.1 檢測波長的選擇

雙藿苷 A、淫羊藿屬苷A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷 C、意卡瑞苷 A和去多甲基羥基淫羊藿素結構相似(圖 1),在本文流動相中的紫外光譜最大吸收均在 270 nm,故選擇 270 nm為吸收波長。

圖 1 七種對照品結構示意圖Fig.1 Structure of seven reference substances

2.2 色譜條件

查閱文獻可知,對化合物 2～5的 HPLC分離分析多采用酸性系統(tǒng)流動相[9,10],但這種方法在大量樣品的長期分析中,對色譜柱的壽命有非常嚴重的損害。因此,本文采用不含酸的梯度洗脫方法對化合物 1～7進行分離和分析,結果良好。色譜柱: WATERS SUNFIRET M-C18柱(5μm,4.6×250 mm);流動相:乙腈 -水,梯度洗脫,柱溫:25℃;靈敏度0.02AUFS;流速:1 mL/min;檢測波長 270 nm;分別采用四種梯度條件進行分離 (表 1),結果在條件 2 (乙腈:0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%)下,七種化合物的分離分析在 30 min內(nèi)實現(xiàn),各成分的分離度和保留時間均較好的滿足了常規(guī)分析要求。在上述條件下,各對照品及樣品的色譜圖如圖 2,七種成分色譜峰理論塔板數(shù)分別為8710(1號峰)、4850(2號峰)、21195(3號峰)、 19862(4號峰)、2828(5號峰)、4508(6號峰)、6322 (7號峰),峰間分離度分別為 2.15(1,2峰)5.53 (2,3峰)、2.25(3,4峰)2.33(4,5峰)、3.32(5,6峰)、6.05(6,7峰)。

表 1 化合物 1～7色譜行為與條件的考察Table 1 Chromatographic behavior of compound 1-7 with different HPLC mobile phases

圖 2 對照品及樣品的HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量,制備成一定濃度的對照品儲備液,使?jié)舛确謩e為:雙藿苷 A 0.060 mg/ mL,淫羊藿屬苷A 0.0470 mg/mL,朝藿定 C 0.0540 mg/mL,淫羊藿苷 0.0705 mg/mL,意卡瑞苷 A 0.1488 mg/mL,淫羊藿屬苷 C 1.6580 mg/mL,去多甲基羥基淫羊藿素 0.9280 mg/mL。

2.4 樣品提取方法的考察

預實驗表明,淫羊藿中的七種化合物分為兩大類群,化合物 1～4可溶于水,而化合物 5～7難溶于水,故實驗設計分別取淫羊藿藥材各 100 g,以水和70%乙醇分別用超聲和回流方法提取,比較產(chǎn)率和含量,確定了最優(yōu)方法:70%乙醇超聲提取 1 h(表2)。

2.5 供試品溶液的制備

取各淫羊藿樣品的干燥植物,于 60℃下烘 3 h,取烘干品,粉碎,過 40目篩,精密稱取約 0.2 g,置50 mL具塞錐形瓶中,加入 70%乙醇 30 mL,稱重,超聲提取 1 h,稱重并補足減失重量,離心,過濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液用微孔濾膜 (4.5μm)過濾,作為供試品溶液。

2.6 線性關系的考察

表 2 提取條件的考察 (n=3,藥材粉末以 100 g計)Table 2 Results of different extraction procedure(n=3,m=100 g)

精密吸取上述化合物 1～5對照品溶液,依次進樣 1、5、10、15、20、25、30、35、40μL,精密吸取上述化合物 6～7對照品溶液,依次進樣 1、2、3、4、5、6、7、8、10μL,按色譜條件,實驗中分別以信噪比的三倍和 10倍定義檢測限LOD和定量限 LQD,測定峰面積,以峰面積為縱坐標,以對照品進樣量為橫坐標,繪制標準曲線,雙藿苷 A、淫羊藿屬苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷 C、意卡瑞苷 A和去多甲基羥基淫羊藿素的線性回歸方程如表 3。

表 3 對照品線性回歸結果Table 3 Determination results of the seven standard substances linear equations

2.7 精密度實驗

精密吸取各對照品溶液 20μL,連續(xù)進樣 6次,測定峰面積,結果 7種成分含量測定值的 RSD分別為:淫羊藿屬苷A 1.19%,雙藿苷A 1.46%,淫羊藿苷 0.45%,朝藿定 C 0.39%,淫羊藿屬苷 C 1.74%,意卡瑞苷 A 0.72%和去多甲基羥基淫羊藿素1.45%。各成分保留時間的 RSD分別為淫羊藿屬苷A 0.16%,雙藿苷A 0.11%,淫羊藿苷0.09%,朝藿定 C 0.13%,淫羊藿屬苷 C 0.31%,意卡瑞苷 A 0.29%和去多甲基羥基淫羊藿素 0.25%。

2.8 重復性實驗

取同一樣品(兩年生巫山淫羊藿根)6份,按樣品制備方法制備供試品溶液,各取 20μL進樣,測定峰面積,計算得七種成分的含量分別為:2.090%, 0.373%,3.054%,0.106%,1.134%,0.104%, 0.005%,各成分含量的 RSD分別為淫羊藿屬苷 A 0.028%,雙藿苷 A 0.019%,朝藿定 C 0.062%,淫羊藿苷 0.008%,淫羊藿屬苷 C 0.036%,意卡瑞苷A 0.003%和去多甲基羥基淫羊藿素 0.001%。

2.9 對照品穩(wěn)定性實驗

精密吸取混合對照品溶液 20μL分別于配制后的 0、4、8、16、24、48 h內(nèi)進樣,測定峰面積。計算 7種成分的 RSD分別為 0.9%、0.6%、0.8%、0.4%、0.7%、0.5%、0.9%。結果表明,對照品溶液在 48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率

準確稱取已測知含量的巫山淫羊藿根樣品 5份,每份約 0.2 g,平行操作,分別定量加入淫羊藿屬苷A、雙藿苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷C、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素對照品溶液,待自然揮干后,按供試品溶液制備方法操作,并按上述色譜條件測定峰面積,計算七種成分的平均回收率和 RSD,結果見表 4。

表 4 加樣回收率試驗結果(n=5)Table 4 Recovery rate of samples(n=5)

由表 4可見七種成分回收率為 97.96%～101.04%,效果良好,表示了樣品處理中七種主要成分提取完全。

3 結果

3.1 同一植物不同部位樣品含量的測定

取巫山淫羊藿根、莖、葉,按供試品溶液制備方法操作,每次進樣 20μL,按照色譜條件測定峰面積,以外標法計算含量,結果見表 5。

表 5 同一樣品不同部位的含量測定結果(n=3,%)Table 5 Results of content determination of different samples(n=3,%)

3.2 不同品種樣品含量的測定

取不同品種淫羊藿(兩年生)的地上部分,按供試品溶液制備方法操作,每次進樣 20μL,按照色譜條件測定峰面積,以外標法計算含量,結果見表 6。

表 6 不同品種樣品的含量測定結果 (n=3,%)Table 6 Results of content deter mination of different samples(n=3,%)

4 討論

4.1 本實驗采用梯度洗脫方法首次同時分離測定了雙藿苷 A、淫羊藿屬苷A、朝藿定 C和淫羊藿苷、淫羊藿屬苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羥基淫羊藿素七種成分在不同部位、不同品種淫羊藿中的分布,色譜條件穩(wěn)定,測定結果可靠。由表 5可知,朝藿定C、雙藿苷 A、淫羊藿苷在巫山淫羊藿根、葉中較多,而在莖中次之。但值得注意的是巫山淫羊藿各部位中朝藿定 C的含量遠遠大于淫羊藿苷,尤其是在根中,除主要含朝藿定 C外的另一種成分雙藿苷 A的含量也達到 2%,兩者的含量分別為現(xiàn)行質量控制指標淫羊藿苷的 20倍和 30倍,可見巫山淫羊藿顯著不同于其它品種的淫羊藿,朝藿定 C在其藥用效果中可能比淫羊藿苷扮演著更重要的角色 (尤其是在根部作為藥用時),這也為民間將巫山淫羊藿根作為小黃連使用提供了一定的實驗支持。中國藥典對淫羊藿的含量測定項只測淫羊藿葉中的淫羊藿苷,顯然不適于巫山淫羊藿品種[7]。

4.2 由表 6可知,不同品種的淫羊藿中主要成分含量有較大差異,但總黃酮的主要部分為這七種化合物,在考慮藥材及制劑質量時,對于品種較多,分布資源較廣的淫羊藿藥材,作為藥用時,應注意品種和藥用部位,考察藥材的內(nèi)在質量,不能一概而論。實驗所得到的方法能被用做淫羊藿植株中二次代謝產(chǎn)物分布的快速考察、篩選符合要求的淫羊藿原藥材和淫羊藿制備藥物中的質量考察。

4.3 流動相的選擇:實驗選擇了乙腈-水(25∶75)衡流洗脫和乙腈-水(梯度洗脫)體系,考慮到常規(guī)分析中的快速測定,從分離情況和出峰時間等綜合分析選擇乙腈-水梯度洗脫,選擇梯度洗脫條件 2(乙腈: 0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%),在 30 min內(nèi)很好的完成了七種成分的快速分離與分析。

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Separation and Simultaneous Quantification of Seven Prenylflavones from Organs of differentEpim ediiUsing Gradient Reverse-phase HPLC

XIE Juan-ping1＊,SUN Wen-ji2

1Departm ent of Chem istry,Ankang University,Ankang 725000,China;2B iology and M edicine Key Laboratory of Shaanxi Province,NorthwestUniversity,Xi’an 710069,China

A s imple and rapid gradient reverse-phase HPLC method for separation and simultaneous determination of the seven prenylflavones,diphylloside A,ep imedoside A,Epimediin C,icariin,epimedoside C,icarisoside A,and desmethylanhydroicaritin in different organs(roots,stems,leaves)ofEpimedii wushanensefor the first time has been developed. Especially,diphylloside A,icarisoside A and desmethylanhydroicaritin(never found any reports of the detection by HPLC)were determined inEp im ediifor quality control in the first time,comparison of three RP-HPLC methods and three extraction methods,quantification and comparison of each prenylflavone in leaves ofEpim ediiwushanensewith other nineEpim ediispecies.W ith thismethod,we obtained good retention times and resolution of seven Compounds.Concentration of all seven components varied between plantorgans,Epimediin C was higher than icariin(the Compound typically used to evaluateEpim ediiquality)in leaves ofEpimedii.diphylloside A andEpim ediin C were 20 and 30x higher, respectively,than icariin in the roots ofE.wushanenseT.S.Ying,and the quantification ofEp im ediin C was higher far away from otherEpim ediispecies.Thus,Ep im edii wushanenseis a special species ofEpimedii,Epimediin C is likely to play a more important role than icariin inEp im edii wushanense,especially,roots ofEpim edii wushanenseshould be exploit(it has been used to therapydisease as well asCoptidis phizom ain china in civilian).The method could be applied toseek regularity in secondarymetabolites distribution,screen raw materials in search for highly qualityplants and itsmedical preparations.

Epim edii;prenylflavones;separation;quantitative determination;RP-HPLC

R284;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0820-06

2009-01-07 接受日期:2009-07-06

安康學院高層次人才啟動經(jīng)費資助項目(AYQD ZR200801)

＊通訊作者 Tel:86-915-3261415;E-mail:xjp_731205@163.com