魏克強(qiáng),楊俊仙,魏治中

煙草與紫蘇科間遠(yuǎn)緣雜種后代化學(xué)成分及醫(yī)藥成分的研究

魏克強(qiáng)1,楊俊仙2＊,魏治中3

1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太原 030006;2山西大學(xué)經(jīng)濟(jì)與工商管理學(xué)院,太原 030006;3山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801

為利用藥用植物資源以緩解吸煙與健康的矛盾,通過創(chuàng)新育種的方法將普通煙草品種 78-04與紫蘇進(jìn)行科間遠(yuǎn)緣雜交,對選育出的新型煙草穩(wěn)定品系—紫蘇煙的內(nèi)在化學(xué)成分及醫(yī)藥成分進(jìn)行分析。酯酶與過氧化物酶同工酶分析證實,通過藥用植物與煙草基因間的漸滲、交流以及重組,紫蘇煙中轉(zhuǎn)入了父本紫蘇的遺傳物質(zhì)。煙葉主要化學(xué)成分分析顯示,紫蘇煙具有低糖、中高煙堿的特點,蕓香苷的含量比親本普通煙草品種 78-04提高了 70.4%。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)初步分析表明,紫蘇煙中含有α-丁香烯、β-丁香烯、芳樟醇和薄荷醇等紫蘇揮發(fā)油的成分,與紫蘇比較其薄荷醇的含量提高了 2倍多;并產(chǎn)生了α-桉醇、香葉烯、桉油精、愈創(chuàng)木奧、α-郁金烯和γ-欖香烯等親本所沒有的醫(yī)藥成分和香料成分。藥用植物與普通煙草科間遠(yuǎn)緣雜交能創(chuàng)造變異、產(chǎn)生煙草新類型,對降低卷煙產(chǎn)品的危害性具有一定作用,紫蘇煙在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域也具有很高的綜合利用價值。

煙草;紫蘇;同工酶;化學(xué)成分;揮發(fā)油

遠(yuǎn)緣雜交育種通過引進(jìn)外源基因可以改良品種、創(chuàng)造變異、形成新物種和新類型。我國藥用植物資源豐富,應(yīng)用中草藥的歷史悠久,國內(nèi)已有利用藥用植物來改善異科植物品質(zhì)方面的研究。但是,由于難以克服遠(yuǎn)緣雜交不親合性,異科植物間的雜交難度大、成功機(jī)率小,迄今獲得成功的報道僅有幾例:通過復(fù)態(tài)導(dǎo)入法將水稻 (O ryza sativa ssp.japonica)品種通育 211與柳葉菜科植物月見草 (Oenothera biennisL.)進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交,獲得了具有育種價值的水稻新種質(zhì)[1];或采用原生質(zhì)體融合法獲得了葡萄(Vitis viniferaL.)與傘形科植物狹葉柴胡 (B upleurum scorzonerifoliumW illd)的再生雜種植株[2];或利用無性嫁接和有性雜交相結(jié)合的創(chuàng)新育種方法分別將普通煙草 (N icotiana tabacumL.)品種與唇形科植物羅勒 (Ocim um bailicumL.)或紫蘇[Perilla frutescens(L.)Britt.]遠(yuǎn)緣雜交,選育出了具有較高工業(yè)利用價值的新型煙草穩(wěn)定品系羅勒煙和紫蘇

煙[3,4]。

紫蘇為唇形科一年生草本植物,其性溫、味辛,具有解表、散寒、下氣、消痰和潤肺等功效,是目前極具開發(fā)利用價值的新資源植物[5]。煙草與中草藥同源,為茄科植物煙草的全草,含有多種藥食功能的成分,是一種特殊的天然植物藥,具有鎮(zhèn)靜、消腫、解毒、殺蟲等功效[6]。煙草制成卷煙后吸食其煙氣具有興奮、提神的作用,然而長期吸煙有害健康,可以引發(fā)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、惡性腫瘤等疾病。研究表明,中草藥在降低卷煙煙氣中的有害物質(zhì)、提高吸食品質(zhì)等方面具有顯著效果[7]。為了充分利用我國傳統(tǒng)的藥用植物資源以緩解吸煙與健康的矛盾,我們采用無性嫁接與有性雜交相結(jié)合的方法,培育出了普通煙草與紫蘇科間遠(yuǎn)緣雜種后代穩(wěn)定品系—新型煙草紫蘇煙 (Zisu tobacco)[4]。本研究對紫蘇煙煙葉的主要內(nèi)在化學(xué)成分與揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,為其在卷煙、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用植物紫蘇(父本):種子由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所提供;普通煙草品種 78-04(母本,為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的烤煙品系)以及紫蘇煙:種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)藥煙育種研究室提供。試驗材料栽培于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。

1.2 儀器

垂直平板電泳儀器 (DYY-Ⅲ型,北京六一);高速冷凍離心機(jī) (D-37520,德國 Sigma);紫外-可見分光光度計 (UV-260,日本島津);凱氏定氮儀 (DDY-2S型,上海華巖儀器設(shè)備有限公司);Dionex Summit HPLC (美 國 Dionex);Agilent 6890GC/Agilent 5973MS氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 同工酶分析

參考庚正平等 (1989)[8]垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法。待紫蘇、78-04及其雜交后代紫蘇煙長到 6～10片幼葉時,分別取幼葉 0.5 g,加入 0.5 mL Tris-檸檬酸緩沖液 (pH 8.9),冰浴中研磨成勻漿,離心,取上清液,加入 0.5 mL 10%(V/ V)甘油,冰箱保存?zhèn)溆?。凝膠緩沖液為 Tris-檸檬酸系統(tǒng)(pH 8.9),分離膠濃度 10%,濃縮膠濃度 4%,電極緩沖液為 Tirs-Gly系統(tǒng) (pH 8.7),電泳時每孔加樣 50μL,260 V電泳 4 h。電泳完畢,酯酶同工酶用堅牢藍(lán)醋酸-α-萘酯法染色,過氧化物同工酶用醋酸聯(lián)苯胺顯色法染色。

1.3.2 煙葉主要內(nèi)在化學(xué)成分測定

依據(jù) GB2635-92(烤煙)的分級方法,待煙草成熟采收烘烤后,分別取 78-04和紫蘇煙中部葉 C3F 0.5 kg,參考文獻(xiàn)[9]的方法分析煙葉主要內(nèi)在化學(xué)成分:總糖采用蒽酮比色法,還原糖采用苦味酸比色法,煙堿采用紫外分光光度法,總氮采用凱氏定氮法,并計算出蛋白質(zhì)、施木克值、糖堿比和氮堿比。取開花期的無病紫蘇葉及上述煙葉,采用高效液相色譜法測定蕓香苷的含量[10]。

1.3.3 揮發(fā)油成分測定

按 1.3.2的取樣方法采集煙葉和紫蘇葉樣品,新鮮的紫蘇葉于陰涼處晾曬 2～3 d、粉碎、水蒸汽蒸餾裝置提取、乙醚萃取,萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后濃縮回收,得到具有芳香氣味的黃色揮發(fā)油。煙葉經(jīng)去梗、干燥(60℃,12 h)、粉碎、進(jìn)行同時蒸餾萃取,萃取完成后向萃取液中加入適量的無水硫酸鈉,靜置過夜,將二氯甲烷萃取液濃縮至 1 mL,加入一定量的乙酸苯乙酯(內(nèi)標(biāo))。依據(jù) JY/T 003-1996有機(jī)質(zhì)譜分析方法通則,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院用Agilent GC/MS 6890/5973進(jìn)行色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測,初步對其揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量分析。

色譜條件:HP-5彈性石英毛細(xì)柱 (30 m×320 μm×0.25μm);程序升溫:初始溫度 60℃,以 5℃/min升溫到 260℃;載氣為氦氣;柱流量 1.0 mL /min;進(jìn)樣口溫度為 280℃。質(zhì)譜條件:EI電離源,電離能量 70 eV;離子源溫度 230℃,氣質(zhì)接口溫度280℃;掃描范圍 30～500 amu;進(jìn)樣量 1μL,分流比 40∶1;定性分析:通過 G1701BA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) (Agilent),檢索N IST98譜圖庫確定各化學(xué)成分。定量分析:通過 G1701BA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),按面積歸一化法進(jìn)行定量分析,分別得出各化學(xué)成分的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 同工酶譜測定結(jié)果

基因決定遺傳性狀,酶是基因的產(chǎn)物,是基因表達(dá)的結(jié)果。同工酶在很大程度上能反映植物個體間的遺傳差異,利用雙親的同工酶特征酶帶是鑒定遠(yuǎn)緣雜交真?zhèn)蔚挠行Х椒ㄖ弧ｕッ竿っ缸V條帶顯示,紫蘇煙與父本紫蘇有一條共同帶,而母本 78-04沒有;與母本有兩條共同帶但父本紫蘇沒有;三者還有一條共同帶,共有 12條。過氧化物酶電泳圖譜顯示共有 9條帶,其中,紫蘇煙與紫蘇有一條共同帶,而 78-04沒有;三者有一條共同帶;紫蘇煙還有一條新帶(圖 1)。結(jié)果表明,普通煙草與紫蘇的遺傳物質(zhì)分別遺傳給了其雜種后代,同時也有一些變異,出現(xiàn)了雙親所沒有的新增酶帶,這可能是由于紫蘇煙獲得了父本的遺傳物質(zhì),異源DNA在細(xì)胞中不斷地被排斥、分離、重組和最后穩(wěn)定的過程中導(dǎo)致同工酶變異。

2.2 化學(xué)成分測定結(jié)果

紫蘇煙與親本煙草比較,其株高、葉片大小、單株葉數(shù)、生育期、株型等農(nóng)藝性狀基本相似,只有個別性狀傾向于親本紫蘇,如葉呈橢圓形,葉色深綠,葉背面略顯紅色,腋芽生長勢強(qiáng),葉片較厚,葉及葉脈較脆[4]。取葉片分析顯示,紫蘇煙的主要內(nèi)在化學(xué)成分與其親本 78-04之間存在一定差異 (表 1):與 78-04比較紫蘇煙的總糖、還原糖、總氮、煙堿、蛋白質(zhì)及蕓香苷的含量分別提高了 51.37%、7.25%、31.55%、75.42%、26.22%和 70.4%;施木克值提高了 19.05%,總糖與煙堿、總氮與煙堿的比值分別降低了 13.75%和 24.68%。對我國 1998-2004年煙草種質(zhì)資源調(diào)制煙葉的統(tǒng)計表明,烤煙中化學(xué)成分的平均含量分別為:總糖 23.08%,還原糖19.63%,總氮 2.00%,煙堿 1.99%,蛋白質(zhì)10.32%,施木克值 2.45,總糖/煙堿 l4.21,總氮/煙堿 1.15[11]?？梢?紫蘇煙具有低糖、中高煙堿的特點;并且,紫蘇煙中蕓香苷的含量比我國主要產(chǎn)區(qū)槐米的蕓香苷含量 (0.278～0.365 mg/g)高 4～5倍[12]。

圖 1 幼苗同工酶電泳圖譜Fig.1 Isozymes zymogram of offsprings

表 1 紫蘇煙主要內(nèi)在化學(xué)成分的測定結(jié)果Table 1 Analytical result of chemical components in Zisu tobacco

2.3 揮發(fā)油成分測定結(jié)果

采用 GC/MS法測定紫蘇、78-04和紫蘇煙揮發(fā)油的成分,分別從中初步確定了 13、22和 30個化合物,總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 55.59%、28.09%和 35.95%,其余成分還有待于進(jìn)一步分析鑒定。對其揮發(fā)性成分進(jìn)行比較表明 (表 2),紫蘇煙主要呈現(xiàn)以下 4個特點:(1)利用煙草與紫蘇進(jìn)行科間遠(yuǎn)緣雜交,紫蘇的部分醫(yī)藥成分遺傳給了雜種后代。紫蘇煙中轉(zhuǎn)入了α-丁香烯、β-丁香烯、芳樟醇和薄荷醇等紫蘇揮發(fā)油成分;(2)可能由于雙親基因互作,雜種后代產(chǎn)生了新的醫(yī)藥成分和香料化學(xué)成分,主要有α-桉醇、香葉烯、桉油精、愈創(chuàng)木奧、α-郁金烯和γ-欖香烯等;(3)紫蘇煙中多數(shù)醫(yī)藥成分含量低于父本,少數(shù)高于父本。紫蘇煙中β-丁香烯、芳樟醇的含量分別比紫蘇低 78.47%和 86.54%,而薄荷醇的含量卻提高了 2倍多;(4)紫蘇煙還含有與 78-04中成分或含量不同的其他揮發(fā)性物質(zhì)。可見紫蘇煙含有獨特的醫(yī)藥成分,這是普通煙草所不具備的特征特性。

表 2 紫蘇煙及其親本的主要揮發(fā)性成分及其含量(相對含量/%)Table 2 Chemical components and relative contents of essential oil from Zisu tobacco(Relative contents/%)

注:“-”表示未檢出。Note:“-”:unidentified.

3 討論

研究表明,一些中草藥可以降低卷煙煙氣中的有害物質(zhì)、清除自由基、抑制焦油的致突變性,甚至研制藥物型、保健型卷煙[7]。目前,在卷煙的生產(chǎn)中中草藥成分的添加工藝基本上是采用三種方式:提取中草藥成分在潤葉時隨料加入,提取中草藥的揮發(fā)油類物質(zhì)隨香加入或以藥物本身的自然形態(tài)攙兌在被加工的煙葉中[13]。卷煙燃吸后使中草藥的有效成分部分進(jìn)入吸煙者的呼吸系統(tǒng),從而起到局部或全身的作用。紫蘇煙中煙草傳統(tǒng)的化學(xué)成分與產(chǎn)生的醫(yī)藥成分處于同一植物體中,這從煙葉原料上就增加了有利于人體健康的醫(yī)藥成分,可以節(jié)省大量的中草藥,為利用中草藥資源以降低卷煙產(chǎn)品的危害性提供了一條新途徑。煙葉是滿足人們吸食需要的特殊商品,其感官評吸特征是煙葉品質(zhì)優(yōu)劣最直接、最權(quán)威和最客觀的反映。評吸結(jié)果顯示,紫蘇煙表現(xiàn)出香味獨特,余味純凈,勁頭適中,各種成分比較協(xié)調(diào)的特性[4]。

我國紫蘇資源豐富,分布廣泛,其莖葉中的精油含量一般為 0.3%～0.7%,已分離鑒定的揮發(fā)性成分達(dá)百余種,主要有紫蘇醛、檸檬烯、芳樟醇、呋喃酮類衍生物、丁香烯、肉豆蔻醚以及蒎烯、薄荷醇、苯甲醛、丁香油酚等。紫蘇精油通常用來治療哮喘病或制取煙草和食品加工業(yè)中的甜味劑-紫蘇醛反肟[14]。目前,煙草除作為一種較安全的燃吸材料外,從中分離提取的葉蛋白(LPC)、氨基酸、茄尼醇、煙堿、果膠、綠原酸、蕓香苷等在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域還具有極高的利用價值[6]。其中,蕓香苷是由已糖或戊糖與多酚槲皮素組成的黃酮類化合物,具有多方面的生物活性,主要存在于豆科植物槐 (Sophora japonicaL.)的花蕾 (槐花米)、果實 (槐角)中,也是煙草中含量較高的酚類物質(zhì)之一,其含量因煙草類型和品種而不同。但是由于槐米資源不足,目前我國蕓香苷的生產(chǎn)還不能充分滿足市場需求。試驗表明,以紫蘇為親本與不同普通煙草品種的雜交后代,均可以大幅度提高煙葉中蕓香苷的含量[4],這為提取寶貴的醫(yī)藥原料提供了新的來源。

遠(yuǎn)緣雜交是引進(jìn)外源基因創(chuàng)造變異的重要途徑,通過藥用植物與煙草基因間的漸滲、交流以及重組,可以形成煙草新類型,紫蘇煙呈現(xiàn)出含醫(yī)藥成分,香氣獨特,低糖、中高煙堿等特點,其毒理學(xué)實驗結(jié)果與親本煙草品種 78-04比較沒有顯著差異[4]。對煙草的藥用價值歷代本草和中醫(yī)藥文獻(xiàn)均有所論述,而紫蘇煙的藥理作用尚待深入研究。研究表明,大多數(shù)藥用植物的有效成分、植物的揮發(fā)性物質(zhì)以及煙草中的煙堿、蕓香苷等均是次生代謝產(chǎn)物,而遺傳是決定植物次生代謝產(chǎn)物種類的決定因素,次生代謝物的合成途徑通常是以代謝頻道的形式存在[15]。究竟是由于轉(zhuǎn)入的紫蘇遺傳物質(zhì)導(dǎo)致的基因突變還是煙草與紫蘇的基因互作對次生代謝物的合成途徑進(jìn)行了調(diào)控,這些深層次的機(jī)制探索對充分開發(fā)利用我國豐富的藥用植物資源以及進(jìn)一步提高煙草的綜合利用價值均具有重要意義。

1 Chu XC(初秀成),Zhao JH(趙基洪),Chai Y(柴楊),et al.Inter-family distant hybridization of rice andOenthera biennis.J Agric B iotech(農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報),2008,16:320-325.

2 Song XQ(宋錫全),Xia G M(夏光敏),Zhou AF(周愛芬),et al.Regenerated plants of somatic hybrids betweenV itis viniferaL.and Bupleurum scorzonerifolium W ild.Chin Sci Bull(科學(xué)通報),1999,44:1832-1836.

3 Wei KQ(魏克強(qiáng)),Yang JX(楊俊仙),Wei ZZ(魏治中). The pr imary research of chemical components and medicine ingredients from new-type tobacco.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2008,20:652-656.

4 Wei ZZ(魏治中),Wei KQ(魏克強(qiáng)).Distant Hybridization Breading of Tobacco(煙草遠(yuǎn)緣雜交育種).Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2008.11-31.

5 Wang YP(王玉萍),Yang JS(楊峻山),Zhao YJ(趙楊景),et al.A review on the chemistry and phar macology ofPerillaL..Chin Phar m J(中國藥學(xué)雜志),2003,38:250-253.

6 Layten DD,Mark NT.Tobacco Production,Chemistry and Technology.UK London:Blackwell Science Limited,1999. 18.

7 Meng DL(孟冬玲),Liu SH(劉紹華).The development and application of herbal medical addition to chinese cigarette.J Chin Tobacco Sci(中國煙草科學(xué)),2006,3:19-21.

8 Yu ZP(庾正平),Wang FD(王富德),Xu LH(徐麗華),et al.A study on esterase isozymes in germinating seeds of kaoliang.Acta Agro Sin(作物學(xué)報),1989,15:36-45.

9 Xiao XZ(肖協(xié)忠).Tobacco Chemistry(煙草化學(xué)).Beijing:Chinese Agricultural Press,1997.47-52,162-205.

10 Yang HQ(楊虹琦),Zhou JH(周冀衡),Shao Y(邵巖),et al.Analysis on the content of chlorogenic acid and rutin in the flue-cured tobacco leaves of different producing areas.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2006,18:670-673.

11 Zhao LH(趙立紅).Primary analysis on the chemic component of tobacco leaf.China Seeds(中國種業(yè)),2006,5:37.

12 Li PF(李培凡),Zhang YH(張韻慧),XiaoL(肖莉),et al. RP-HPLC determination of rutin in sopbora rice from different habits.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥 ),2006,37: 1419-1420.

13 Wang YL(王艷麗),Ma L(馬林),Sun JS(孫君社),et al.The research development of healthy cigarettes.Food Sci(食品科學(xué)),2005,26:199-121.

14 Liu YX(劉月秀),Zhang WM(張衛(wèi)民),Qian XS(錢學(xué)射 ).Research and utilization of genusPerilla.Chin W ild Plant Resour(中國野生植物資源),1996,3:24-27.

15 He SL(何水林),Zheng JG(鄭金貴),Wang XF(王曉峰),et al.Plant secondary metabolism:function,regulation and gene engineering.Chin J Appl Environ B iol(應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報),2002,8:558-563.

Chem ical Components andM edicine Ingredients in the Hybrid of Fam ilies between Tobacco andM edicinal Plant Perilla frutescens(L.)Britt

WEI Ke-qiang1,YANG Jun-xian2＊,WEI Zhi-zhong3

1School of L ife Science,ShanxiUniversity,Taiyuan 030006,China;2School of Econom ics and Business Adm inistration,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;3College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China

In order to release the contradiction between s moking and smoker’s health,the distant hybridization between tobacco and medical plantswas expected to incubate the new-type tobacco which included medical ingredients.The hybridization wasmade be tween 78-04(a variety ofN icotiana tobacumL.)and medicinal plantPerilla frutescens(L.) Britt,and a new hybrid descendent,designated as Zisu tobacco,was obtained.Analysis of esterase and peroxidase isozymes in parents and their filial generation proved that heredity substance in medical plantPerilla frutescens(L.) Britt.was introduced into Zisu tobacco.The results of the analysis of chemical components showed that Zisu tobacco had characteristics of low-sugar,middle or high nicotine content,and the contentof rutin increased by 70.4%comparedwith that in female parent tobacco.Chemical constituents of the volatile oilwere extracted and preliminarily analyzed by GC/ MS.The results revealed that the contents of essential oil inPerilla frutescens(L.)Britt,such asα-caryophyllene,βcaryophyllene,linalool andmenthol,was introduced in Zisu tobacco,and the contentofmenthol in itwas two t imes higher than inPerilla frutescens(L.)Britt.Many new medicine ingredients and flavor componentswere found in Zisu tobacco, such asα-eudesmol,myrcene,eugenol,guaiazulene,α-cureumene andγ-elemene.This study indicated that distant hybridization between tobacco andPerilla frutescens(L.) Britt could induce variation and generate new-type tobacco, which had important role not only in reducing harmfulness in cigarette but also in the comprehensive utilizations in food and phar maceutical fields.

tobacco;Perillafrutescens(L.) Britt; isoenzyme;chemical components;volatile oil

Q946.91;R284.1;S572

A

1001-6880(2010)05-0801-06

2009-03-24 接受日期:2009-07-06

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(200801081012);國家煙草專賣局重點科技項目(110199901005);山西省科技產(chǎn)業(yè)化環(huán)境建設(shè)計劃項目(2006071033);山西省人才引進(jìn)與開發(fā)專項資金資助項目(2008)

＊通訊作者 Tel:86-351-7018206;E-mail:kqwei@sxu.edu.cn