徐紅娟,莫志宏,余佳文,毛先兵,朱華李

1重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400044;2重慶市中藥研究院,重慶 400065

菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活性跟蹤,采用NKA大孔吸附樹脂和硅膠兩步柱色譜對(duì)蟬花中抗真菌活性成分進(jìn)

蟬花抗真菌活性成分的分離純化研究

徐紅娟1,2,莫志宏1,余佳文1,毛先兵2＊,朱華李2

1重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400044;2重慶市中藥研究院,重慶 400065

菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活性跟蹤,采用NKA大孔吸附樹脂和硅膠兩步柱色譜對(duì)蟬花中抗真菌活性成分進(jìn)

通過抗真行分離純化;并通過紅外、質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明,分離得到的抗真菌活性成分為多球殼菌素,對(duì)真菌的最小抑制濃度為 0.02 mg/mL。本研究為進(jìn)一步研究蟬花及制備醫(yī)藥工業(yè)所需的多球殼菌素提供了依據(jù)。

蟬花;抗真菌活性;分離純化;大孔吸附樹脂;硅膠柱色譜;多球殼菌素

蟬花 (C.cicadae)屬蟲生性藥用真菌,是我國(guó)傳統(tǒng)的一種名貴中藥材。由于蟬花與冬蟲夏草同屬蟲菌復(fù)合體,且具有相近的藥用價(jià)值,所以醫(yī)家常將蟬花作為冬蟲夏草的代用品[1]。近年對(duì)蟬花化學(xué)成分、藥理作用進(jìn)行了不少研究,發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物活性。柴一秋等[2]從蟬花中提取得到 N6-(2-羥乙基)腺苷,該化合物具有鎮(zhèn)痛、Ca2+拮抗作用和肌肉收縮的活性。Kuo等從蟬花中分離得到白僵菌酮、白僵菌素甲和白僵菌素乙等多種成分,藥理實(shí)驗(yàn)顯示此類環(huán)肽化合物具有抗腫瘤、抗驚厥、抗心律失常、鎮(zhèn)靜等作用[3,4]。還有文獻(xiàn)報(bào)道蟬花所含化學(xué)成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)菌及抗真菌等多種活性[5-8]。近年來隨著抗生素的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,細(xì)菌及真菌耐藥性增加,致使一些抗生素的療效降低和條件性致病菌增加,在臨床上造成一定的威脅。因而需要不斷篩選新結(jié)構(gòu)和新型抗菌作用的抗生素以滿足臨床需要。目前國(guó)內(nèi)外尚未見對(duì)蟬花進(jìn)行抗真菌活性成分跟蹤篩選的報(bào)道,本研究擬采用此方法對(duì)蟬花進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

2695高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司),包括 2996 DAD檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;FTIR-8000傅立葉變換紅外分光光度計(jì) (日本島津公司);AB IQ-TRAP質(zhì)譜儀 (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

蟬花(C.cicadae)菌種由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得。蟬花菌發(fā)酵采用液體發(fā)酵法[7]。指示菌株白色念株菌(中國(guó)藥品生物制品檢定所),酮康唑 (西安楊森制藥有限公司),牛津杯(本實(shí)驗(yàn)室自制)。

NKA大孔吸附樹脂(天津南開大學(xué)化工廠),柱色譜 200～300目硅膠(青島海洋化工廠分廠),瓊脂粉 (成都市科龍化工試劑廠,批號(hào):070811),乙腈(色譜純,美國(guó) TED IA),水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薄層色譜(TLC)條件

將待檢測(cè)樣品溶于甲醇作為點(diǎn)樣液,用內(nèi)徑0.5 mm的毛細(xì)管在硅膠 GF254薄層板上點(diǎn)樣,樣點(diǎn)干燥后放入密閉的層析缸中展開,展開劑∶氯仿∶甲醇∶水 (6.5∶3.0∶0.5,V/V)。展開后揮干溶劑用碘蒸汽顯色,茚三酮顯色用茚三酮溶液 (質(zhì)量濃度2%)噴霧后于 105～110℃烘箱加熱顯色。

1.2.2 高效液相色譜(HPLC)條件

色譜柱為 Inertsil ODS-3(GL Sciences Inc.,4.6 mm ×250 mm,5μm),流動(dòng)相∶乙腈∶水 (75∶25,V/ V,經(jīng) 0.45μm微孔濾膜抽濾),進(jìn)樣量:10μL,流速:1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):201 nm,柱溫:35℃。

1.2.3 抗真菌實(shí)驗(yàn)方法(杯碟法)

將白色念株菌菌苔刮入無菌水后,配制成濃度為 108CFU/mL菌懸液。將滅菌后的培養(yǎng)基分裝于平板,取該菌懸液 200μL均勻涂布于 PDA固體平板培養(yǎng)基上,用滅過菌的鑷子夾取無菌牛津杯放置于平皿菌層上,定量加入新配制的樣品溶液 200μL于杯內(nèi)。最后將平皿放入 35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[8],同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 (酮康唑)和空白對(duì)照(無水乙醇)。

1.2.4 蟬花菌絲體提取液的制備

將培養(yǎng)好的蟬花菌過濾,所得菌絲體水洗兩次后進(jìn)行干燥處理,稱取干燥菌絲體粉末 5 g,用 95%乙醇50 mL回流提取3次,合并提取液,過濾后于60℃減壓濃縮至干,再用 5 mL無水乙醇溶解,制成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的樣品,離心取上清液以備用。

1.2.5 大孔吸附樹脂柱色譜

取經(jīng)過預(yù)處理的NKA大孔吸附樹脂適量,采用常規(guī)濕法裝柱(Φ15 mm ×400 mm),在裝柱過程中始終保持液面高于樹脂層面 5 cm以上。將蟬花菌絲體提取液用水稀釋至乙醇含量為 20%,以 1 BV/h的流速流過NKA吸附樹脂,使樹脂充分吸附平衡。用乙醇水溶液作為洗脫系統(tǒng),按極性從大到小的順序,選擇不同的梯度進(jìn)行洗脫,每個(gè)梯度為3～4倍柱床體積,洗脫液用 100 mL錐形瓶收集,每瓶 50 mL,于 60℃減壓濃縮蒸干后用甲醇溶解,進(jìn)行抗真菌實(shí)驗(yàn)活性跟蹤,合并抗菌活性較強(qiáng)的餾分,離心后低溫干燥得粗品。

1.2.6 硅膠柱色譜

取適量 200～300目硅膠,用乙酸乙酯拌勻后裝柱(Φ15 mm ×400 mm),用洗脫劑淋洗并平衡色譜柱,備用。大孔吸附樹脂粗品用無水乙醇溶解,攪拌均勻使樣品充分吸附于少量預(yù)處理過的硅膠上后揮干溶劑上樣。洗脫液于 60℃減壓濃縮蒸干后用甲醇溶解,進(jìn)行抗真菌實(shí)驗(yàn)活性跟蹤,合并有抗菌活性且薄層色譜顯色相同的餾分,離心后低溫干燥得純化后樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂柱色譜

蟬花菌絲體提取液通過杯碟法抑制白色念株菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 1(a),從圖中可見提取液 (質(zhì)量濃度為 1.0 g/mL)抑菌圈直徑為1.8 cm,而酮康唑(質(zhì)量濃度為 2.0 mg/mL)的抑菌圈直徑為 2.8 cm(以上抑菌圈直徑均包括牛津杯直徑 0.6 cm在內(nèi)),表明蟬花提取液具有抗真菌作用。為了從蟬花中分離抗菌活性成分,本研究采用 NKA非極性大孔吸附樹脂,并通過抗真菌實(shí)驗(yàn)跟蹤活性成分,用乙醇水溶液梯度洗脫。大孔吸附樹脂的 70%乙醇洗脫液抑制白色念株菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 1(b),從圖中可見 70%乙醇洗脫液 (質(zhì)量濃度為 5.0 mg/mL)抑菌圈直徑為 2.1 cm,表明 70%乙醇洗脫液具有較好的抗菌活性;而上樣流出液、20%乙醇洗脫液及 40%乙醇洗脫液無抗菌活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn),低于 40%乙醇液卻能較好的洗脫糖類、蛋白質(zhì)及色素等極性較大的水溶性雜質(zhì)。因而,采用 20%、40%和 70%乙醇溶液順序梯度洗脫分離抗菌活性成分。

圖1 抗菌效果圖Fig.1 Oxford cup tests ofC.cicadae

2.2 硅膠柱層析

蟬花菌絲體提取液、大孔吸附樹脂 70%乙醇洗脫液在碘蒸氣和茚三酮顯色下的薄層色譜圖見圖2,可見 70%乙醇洗脫液和菌絲體提取液有相近的顯色斑點(diǎn),70%乙醇洗脫液主要富集了蟬花菌絲體提取液靠近薄層板前端的物質(zhì),特別是在Rf為0.65處有相同的顯色斑點(diǎn),而普通顯色劑碘蒸氣顯色較茚三酮顯色顯示更多的物質(zhì)斑點(diǎn)。另外,70%乙醇洗脫液的薄層色譜抑菌實(shí)驗(yàn)顯示 70%乙醇洗脫流出液在Rf為 0.65處具有明顯的抑菌圈 (結(jié)果未給出),因而Rf為 0.65處的物質(zhì)為蟬花的主要抗菌成分。

為了進(jìn)一步純化蟬花抗菌活性成分,本研究選用硅膠柱色譜。用薄層色譜法探索柱層析的分離條件,盡管三氯甲烷/甲醇/水體系展開效果較好 (圖2),但考慮到工業(yè)放大時(shí)此溶劑體系不利于工業(yè)化,故硅膠柱色譜擬選擇毒性較小的洗脫體系。篩選了乙酸乙酯/正丁醇、乙酸乙酯/無水乙醇、乙酸乙酯/無水乙醇/甲酸、乙酸乙酯/無水乙醇/乙酸、乙酸乙酯/無水乙醇/氨水等展開體系,除了乙酸乙酯/無水乙醇/甲酸展開體系,其余展開體系顯色斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重。薄層色譜進(jìn)一步分析顯示乙酸乙酯-無水乙醇-甲酸比例為 7∶3∶1和 6∶4∶1時(shí),主要抗菌活性成分的Rf分別為 0.57和 0.66,符合 0.3≤Rf≤0.7的條件[9]。但由于濕法裝柱的硅膠柱色譜中,固定相預(yù)先吸附了流動(dòng)相,使吸附活性較薄層色譜低,需選用的流動(dòng)相極性要小于薄層色譜,故選用展開劑乙酸乙酯/無水乙醇/甲酸比例為 7∶3∶1作為硅膠柱色譜洗脫系統(tǒng)。

圖2 TLC圖Fig.2 TLC chromatogram

抗真菌活性跟蹤硅膠柱色譜洗脫液并收集了活性餾分,如圖 1b,可見樣品 3(質(zhì)量濃度為 2.0 mg/ mL)抑菌圈直徑為 2.3 cm,表明其具有更強(qiáng)的抗真菌活性。由圖 2b可以看出,硅膠柱色譜洗脫餾分與大孔吸附樹脂 70%乙醇洗脫液在同一比移值Rf為0.65處有相同的顯色斑點(diǎn),且斑點(diǎn)集中,可能是單一成分。但是碘蒸氣顯色不如茚三酮靈敏,當(dāng)兩張薄層板中硅膠洗脫餾分點(diǎn)樣量相同的情況下,圖 2 (a)中樣品 3碘蒸氣顯色斑點(diǎn)幾乎觀察不到。

2.3 硅膠柱色譜洗脫活性餾分最小抑菌濃度的測(cè)定

測(cè)定了蟬花菌絲體硅膠柱色譜洗脫活性餾分不同濃度的抑菌效果,結(jié)果見表 1。

表 1 蟬花菌絲體硅膠洗脫餾分最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Result ofM IC for eluent from silica gel inC.cicadae

由表 1可看出,硅膠柱色譜洗脫活性餾分對(duì)白色念株菌和黑曲霉菌的M IC均為 0.02 mg/mL,顯示了硅膠柱色譜洗脫活性餾分對(duì)真菌具有較強(qiáng)的抗真菌活性,而對(duì)細(xì)菌沒有明顯抑制作用。

2.4 高效液相色譜(HPLC)分析

取硅膠柱色譜洗脫活性餾分 10μL,按 1.2.2項(xiàng)下條件注入液相色譜儀,結(jié)果見圖 3,可見在保留時(shí)間為 10.1 min出現(xiàn)一個(gè)峰,峰形良好 (保留時(shí)間約 3 min的峰為溶劑峰)。對(duì)此峰用DAD檢測(cè)器進(jìn)行光譜圖分析及用Waters色譜工作站軟件進(jìn)行純度檢查(結(jié)果未給出),結(jié)果顯示該峰是單一峰,且為末端吸收。

圖 3 硅膠柱色譜活性餾分HPLC圖Fig.3 HPLC Chromatogram of eluent from silica gel inC.cicadae

2.5 紅外光譜(FTIR)分析

取硅膠柱色譜活性餾分揮干溶劑后的粉末約 2 mg在瑪瑙研缽中充分研細(xì),再加入約 200 mg干燥KBr粉末,繼續(xù)研磨 2～5 min,裝入壓片機(jī)壓成透明薄片,直接放入傅立葉變換紅外分光光度計(jì)中進(jìn)行掃描,掃描范圍 400～4 000 cm-1,所得紅外光譜圖見圖 4。由圖可見,在 3 440.8、2 958.6、2 929.7、1 666.4、1 537.2、1 450.4、1 384.8、1 082.0 cm-1處有較強(qiáng)吸收,與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的多球殼菌素相似。

圖 4 硅膠柱色譜活性餾分紅外圖Fig.4 FTIR of eluent from silica gel inC.cicadae

2.6 質(zhì)譜(MS)分析

取硅膠柱色譜活性餾分 2μL注入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,掃描范圍m/z為 100～800,在 ESI負(fù)離子全掃描方式下,主要生成[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰,得其 (M-H)為 400.3(結(jié)果未給出),分子量為401,與文獻(xiàn)[10,11]報(bào)道的多球殼菌素相同。

3 結(jié)論

本研究對(duì)蟬花中抗真菌活性成分進(jìn)行了分離純化并對(duì)目標(biāo)化合物初步進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。分離純化流程依次采用NKA大孔吸附樹脂吸附、硅膠柱色譜系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明NKA大孔吸附樹脂用于初步分離蟬花抗真菌活性成分是可行的,主要抗菌活性成分在 70%乙醇洗脫液中;進(jìn)一步通過硅膠柱色譜純化得到單一活性成分。綜合上述 TLC、HPLC、FTIR、MS等數(shù)據(jù),可判定硅膠柱色譜活性餾分為多球殼菌素。多球殼菌素顯示了多種顯著的藥理作用,特別是具有顯著的免疫抑制活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化[7,12],值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采取兩步柱色譜分離純化蟬花中的多球殼菌素,工藝簡(jiǎn)單,所用溶劑毒性小、安全,適合工業(yè)生產(chǎn)的要求。

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Separation and Purification of Anti-fungal Compound fromCordyceps cicadae

XU Hong-juan1,2,MO Zhi-hong1,YU Jia-wen1,MAO Xian-bing2＊,ZHU Hua-li2

1College of Chem istry and Chem ical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2Chongqing Academ y of ChineseM ateria M edica,Chongqing 400065,China

The method of separation and purification anti-fungal component from mycelia ofCordyceps cicadaewas established.NKA macroporous adsorption resin and silica gel,two steps of column chromatograph were used to separate the active componentwhich was screened by antifungal experiment,and then the qualitative analysiswas conducted by FTI R andMS.The result indicated thatmyriocin was obtained,which is the main anti-fungal active component inC.cicadae, and showed significant anti-fungal activitywithM IC of 0.02 mg/mL.The resultprovides the valuable basis for better understandingC.cicadaeand preparingmyriocin for pharmaceutical industry.

Cordyceps cicadae;anti-fungal activity;separation and purification;macroporous adsorption resin;silica gel column chromatography;myriocin

R284.2;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0794-05

2008-12-05 接受日期:2009-02-20

重慶市科委科技攻關(guān)項(xiàng)目(8848)

＊通訊作者 Tel:86-23-89029037;E-mail:maoxianb@yahoo.com.cn