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        一種具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的實驗研究

        2010-09-15 04:26:06肖友元何宇新
        關(guān)鍵詞:單純性變性酒精性

        肖友元,何宇新,李 玲,謝 雷

        1四川省人民醫(yī)院,成都 610072;2西華大學(xué)生物工程學(xué)院,成都 610039;3成都自豪藥業(yè)有限公司,成都 610041

        一種具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的實驗研究

        肖友元1,何宇新2*,李 玲2,謝 雷3

        1四川省人民醫(yī)院,成都 610072;2西華大學(xué)生物工程學(xué)院,成都 610039;3成都自豪藥業(yè)有限公司,成都 610041

        為了研究特種脂肪酶 ZFM對大鼠非酒精單純性脂肪肝 NAFLD的防治作用,本次實驗通過給大鼠NAFLD模型灌胃 ZFM,然后進(jìn)行常規(guī)觀察、體重及肝臟器系數(shù)測定、血清中ALT和AST的含量動態(tài)測定、肝臟肉眼大體外觀變化情況觀察、肝組織內(nèi) TG的含量測定、肝組織病理學(xué)分析等。結(jié)果表明,ZFM顯著降低ALT活性及肝組織 TG含量,同時也可減輕肝脂肪變性的程度,說明 ZFM具有顯著的抗大鼠NAFLD的作用。

        特種脂肪酶;非酒精性脂肪肝;甘油三酯;谷丙轉(zhuǎn)氨酶;谷草轉(zhuǎn)氨酶

        非酒精單純性脂肪肝 (Non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)是由于各種肝內(nèi)外因素所致的肝臟脂肪代謝功能障礙,導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì) (主要為三酰甘油)蓄積過多和變性的病理綜合征,包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化[1]。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時,谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (Alanine aminotransferase,ALT)釋放到血液中,血清中 ALT的活力隨之升高,1%的肝臟受損,可以使血清中ALT的濃度增加 1倍。正常情況下,血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶 (Aspartate aminotransferase,AST)的活力不高,但當(dāng)組織細(xì)胞,特別是肝臟和心臟等器官的細(xì)胞發(fā)生病變時,會導(dǎo)致血清中 AST的活力明顯升高[2]。所以,ALT和AST可以比較敏感地監(jiān)測到肝臟是否受到損害。本試驗通過高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精單純性脂肪肝模型,考查特種脂肪酶(ZFM)對大鼠NAFLD的防治作用。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        SD大鼠,體重 230~250 g,雌雄各半(由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供),合格證號SCXK(京)2007-0001;特種脂肪酶(ZFM)受試藥(由成都自豪藥業(yè)有限公司提供,批號:081223),實驗時先用適量吐溫研磨,再用 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設(shè)計濃度配制;易善復(fù) (多烯磷脂酰膽堿膠囊)(塞諾菲安萬特 (北京)制藥有限公司,批號:D8139),實驗時先用適量吐溫研磨,再用 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)按設(shè)計濃度配制。

        1.2 試劑

        膽固醇 (成都科龍化工試劑廠,批號: 20071229);吐溫-80(成都科龍化工試劑廠,批號: 20050402);膽酸鈉 (上海 Solarbio,批號:20060826);丙硫氧嘧啶片(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司,批號: 071105);1,2丙二醇 (天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號:20051128);羧甲基纖維素鈉 (上海三浦化工有限公司,批號:20010911)。

        1.3 儀器

        LD2-5醫(yī)用離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);SHAC恒溫振蕩器(常州國化電器有限公司);T MS-1024i全自動生化分析儀 (日本國東京醫(yī)療公司);BP221型電子天平(SARTOR IOU)。

        1.4 實驗分組與方法

        取 SD大鼠,體重 230~250 g,64只,雌雄各半,隨機(jī)分為 4組,每組動物 16只。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,每天上午各組大鼠分別按表 1設(shè)計劑量給藥,空白組給予相應(yīng)的 CMC混懸液;下午除空白組外,其余各組大鼠分別灌胃給予高脂乳液 (20%豬油、8%膽固醇、1.2%膽酸鈉和 0.6%丙硫氧嘧啶) lmL/l00 g。于第 4周后末次給藥后禁食 16 h(不禁水),眼眶取血,離心并分離血清,動態(tài)測定給藥 4周后的血清生化指標(biāo)。

        于第 6周后末次給藥后禁食 16 h(不禁水),稱取大鼠體重,股動脈取血,離心并分離血清,-30℃低溫保存,待測血清中的生化指標(biāo);另摘取肝臟并稱重,觀察大體外觀后,每只大鼠在相同部位切下 2 g肝組織置于預(yù)冷的生理鹽水中制成 1O%肝勻漿,4℃靜置 48 h后,10000 r/min,離心 20 min,取上清液,用全自動生化儀測定肝組織內(nèi)甘油三酯 (Triglyceride,TG)的含量;另取肝左葉 1塊放于 10%中性福爾馬林溶液,待作肝組織病理學(xué)檢查 (固定后,石蠟包埋,切片作 HE染色)。

        1.5 統(tǒng)計方法

        用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。以(x±s)表示結(jié)果的數(shù)據(jù),用單因數(shù)方差分析進(jìn)行組間比較,肝病理組間差異的顯著性檢驗運用非參數(shù)檢驗Ridit分析方法,顯著性水平為P<0.05,及顯著水平為P<0.01。

        目前,B公司對經(jīng)銷商的培訓(xùn)嚴(yán)重不足,導(dǎo)致經(jīng)銷商無法學(xué)習(xí)到業(yè)內(nèi)優(yōu)秀經(jīng)驗,無法吸取行業(yè)內(nèi)經(jīng)驗教訓(xùn),無法獲取公司最新的經(jīng)營理念和行業(yè)前沿信息,影響經(jīng)銷商管理效果。

        2 結(jié)果

        2.1 常規(guī)觀察

        實驗期間空白組動物活動、飲食正常、皮毛光亮整潔、體重持續(xù)增長,其余各組在灌胃給予高脂乳液兩周后逐漸出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、活動減少、體重增加緩慢、無力、蜷縮、飲食減少、皮毛凌亂、萎黃等。

        2.2 體重及肝臟器系數(shù)測定

        結(jié)果提示,灌胃給予高脂乳液一定周期后,模型對照組體重增加緩慢,和空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01),ZFM劑量組和易善福組在給藥前4周均有抵抗大鼠體重增加緩慢的作用趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。

        另脂肪肝模型大鼠的肝臟指數(shù)較空白組明顯升高(P<0.01);ZFM劑量組和易善福組均有降低脂肪肝模型大鼠的肝臟器系數(shù)的作用趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表 2

        表 2 ZFM對脂肪肝大鼠體重及肝臟器系數(shù)的影響(x±s)Table 2 The effects of the weight of fatty liver and coefficient by ZFM(x±s)

        2.3 血清中ALT﹑AST的含量動態(tài)測定

        血清中ALT﹑AST的含量動態(tài)測定結(jié)果見表3。

        表 3 ZFM對大鼠脂肪肝血清中ALT﹑AST的含量的影響(x±s)Table 3 The effects ofALT﹑ AST in serum of the fatty liver by ZFM(x±s)

        當(dāng)急性肝炎和慢性肝炎和輕型,雖有肝細(xì)胞的損傷,肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整,故釋放入血的只有存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的 ALT,故 ALT升高明顯;重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型,肝細(xì)胞的線粒體也遭到了嚴(yán)重的破壞,AST從線粒體和胞漿內(nèi)釋出, AST也明顯升高。結(jié)果提示,在給予高脂乳液 4周, 6周后,脂肪肝模型大鼠血清中ALT的活性明顯較空白組明顯升高 (**P<0.01);與模型對照組相比,ZFM劑量組及易善復(fù)組均能明顯降低模型大鼠ALT活性 (*P<0.05),表明 ZFM具有一定的降酶作用。

        但脂肪肝模型大鼠血清中AST未明顯升高,原因可能為我們通過高脂乳液造成的非酒精性脂肪肝模型,該模型程度較輕,肝細(xì)胞的線粒體未遭到嚴(yán)重的破壞。

        2.4 肝臟肉眼大體外觀變化情況

        空白組肝臟肉眼觀察呈鮮紅色,邊緣銳利,表面光滑。脂肪肝模型對照組肉眼見肝臟體積增大,邊緣變鈍,顏色呈奶黃色,切面油膩狀,有明顯脂肪顆粒,提示病變基礎(chǔ)是肝細(xì)胞脂肪積聚;ZFM給藥組和易善復(fù)組肝臟肉眼觀察有部分肝臟呈鮮紅色。

        2.5 肝組織內(nèi)甘油三酯的含量結(jié)果見表 4

        表 4 ZFM對脂肪肝大鼠肝組織內(nèi) TG的影響(x±s)Table 4 The effects of the TG in fatty liver by ZFM(x±s)

        注:和模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

        Tagging:Comparison to the model group,*P<0.05,**P<0.01.

        脂肪肝主要是 GT大量堆積于肝臟所致的一種病理改變,因此測定肝組織中 GT的含量尤為重要,結(jié)果提示,非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞內(nèi) GT含量明顯升高,與空白組比較,差異有高度顯著性 (**P<0.01),ZF M劑量組及易善復(fù)組,均能顯著降低大鼠肝組織 GT的含量(*P<0.05),表明 ZF M具有一定的降低大鼠肝脂肪變性的作用。

        2.6 肝組織病理學(xué)分析(HE染色,100×)

        表 5 肝組織病理損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 5 The yardstick of pathological injury of liver

        脂肪空泡融合為大空泡,將細(xì)胞核擠向胞膜下,狀似脂肪細(xì)胞。 重度損傷 +++ 3壞死Necrosis 表示沒有壞死, 無 0點狀壞死,肝小葉內(nèi)可有散在的肝細(xì)胞壞死,每個壞死灶僅累及單個或幾個肝細(xì)胞。 輕度損傷 + 1碎小片狀壞死,肝細(xì)胞呈灶狀壞死,崩解 中度損傷 ++ 2有大片溶解灶性壞死。 重度損傷 +++ 3纖維化 沒有增生 無 0組織增生 Fibrosis tissue 僅有纖維細(xì)胞及少許纖維組織增生,正常肝小葉結(jié)構(gòu)隱約可見。 輕度損傷 + 1有明顯的纖維組織增生,正常肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯,但尚未形成明顯假小葉。中度損傷 ++ 2有大量組織增生,將細(xì)胞圍成小塊呈小島狀,明顯假小葉形成。 重度損傷 +++ 3

        表 6 肝病理分級結(jié)果(表中數(shù)為例數(shù))Table 6 Pathological of liver and results(the number is examples)

        表 7 ZFM對脂肪肝大鼠肝臟病理的影響Table 7 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

        圖 1 ZFM對脂肪肝大鼠肝臟病理的影響Fig.1 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

        由表 6、表 7、圖 1可知,模型組與空白對照組比較,出現(xiàn)了肝細(xì)胞的脂肪變性,經(jīng)非參數(shù)檢驗,具有極顯著性差異 (**P<0.01),表明造模成功;與模型組比較,ZFM劑量組及易善復(fù)組均可顯著降低肝脂肪變性程度 (*P<0.05),表明 ZFM具有一定的降低脂肪肝大鼠脂肪變性的作用。

        但從表 6可知,其中 ZFM劑量組肝壞死評定中,有一只大鼠肝臟病理評分為壞死 2分,經(jīng)仔細(xì)核查,排除原發(fā)性可能,雖然動物實驗數(shù)據(jù)具有一定的動態(tài)波動,也屬正常,同時因供樣量太少,僅有一個劑量,但對于一個抗脂肪肝的新藥來說,以后的研究中,須嚴(yán)密考查該試驗藥長期給藥后,在減輕脂肪變性的同時,是否也會引起肝細(xì)胞的損傷。

        3 結(jié)論

        脂肪肝 (Fatty Liver)作為一種病理學(xué)概念,系指肝內(nèi)脂肪含量超過肝濕重的 5%,或肝活檢 1/3以上肝細(xì)胞有脂肪變性且彌漫分布于全肝。其對應(yīng)的臨床概念是脂肪性肝病 (Fatty Liver Disease,FLD),系指病變主體在肝小葉,以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變(多為大泡性脂肪變)為病理特征的臨床綜合征。目前,按相關(guān)專業(yè)委員會的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)共識可以明確的是:①脂肪性肝病在臨床上根據(jù)患者有無過量飲酒史,分酒精性脂肪性肝病 (酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝病;②酒精性肝病臨床診斷通常分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化;③非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分為單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎 (NASH)和肝硬化三種類型。

        本次實驗研究旨在通過高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精單純性脂肪肝模型,考查該試驗藥對大鼠非酒精單純性脂肪肝的防治作用,實驗結(jié)果表明,模型對照組與空白對照組比較,肝臟器系數(shù)﹑ALT活性、肝組織甘油三酯含量均顯著升高,同時肝病理也顯示出現(xiàn)了一定的脂肪變性,按照專業(yè)委員會的診斷標(biāo)準(zhǔn),該模型屬于非酒精單純性脂肪肝模型;ZFM劑量組和模型對照組比較,可顯著降低ALT活性及肝組織甘油三酯含量,同時也可減輕肝脂肪變性的程度。

        綜上所述:通過微生物發(fā)酵得到的 ZFM試驗藥,具有顯著的抗非酒精單純性大鼠脂肪肝的作用,具有創(chuàng)新藥物開發(fā)前景。同時,對于一個抗脂肪肝的新藥來說,以后的研究再觀察對酒精性脂肪肝的作用做系統(tǒng)的研究,再嚴(yán)密考查該試驗藥長期給藥后,在減輕脂肪變性的同時,進(jìn)一步探討其作用機(jī)理。

        1 Guo LL(郭麗麗),Liu JC(劉近春).The observation of curative efects of polyene phosphatidyl choline in combination with compound salvial injection for nonalcoholic fatty liver disease.J ChangzhiM ed Coll(長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報),2009,2: 117-119.

        2 Zhou X(周新),Xu ZG(徐植光).ClinicalBiochemistry and Biochemistry Test(臨床生物化學(xué)與生物化學(xué)檢驗).Beijing:People's Health Publishing House,2003.238-239.

        Anti-fatty L iver Effect of a kind of L ipase

        XIAO You-yuan1,HE Yu-xin2*,L ILing2,XIE Lei3

        1The People’s Hospital of Sichuan Province,Chengdu 610072,China;2B io-Engineering College of Xihua University, Chengdu 610039,China;3Chengdu Zihao pha rm aceutical Co.,Ltd.Chengdu 610041,China

        To research the preventive and therapeutic effects of ZFM for non-alcohol fatty liver disease(NAFLD),in this experimentwe used ZFM to gavage to the NAFLD model.Investigate the generalobservation,theweightof fatty liver and coefficient,dynamic measurement ofALT and AST,observe the gross appearance by naked eye,measure the TG,analyse the yardstick of pathologicalof liver.The results showed that,ZFM can extraordinary reduce the activity ofALT and TG, and ease liver degeneration.Thus it could be concluded ZFM has extraordinary activity forNAFLD.

        ZFM;NAFLD;TG;ALT;AST

        R575

        A

        1001-6880(2010)05-0781-05

        2009-09-21 接受日期:2010-04-27

        *通訊作者 Tel:86-28-87725898;E-mail:heyuxin66@126.com

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