李宏偉

（贛南師范學(xué)院 體育學(xué)院，江西 贛州 341000）

間歇運(yùn)動對腎上腺髓質(zhì)素特異性受體基因表達(dá)的影響

李宏偉

（贛南師范學(xué)院 體育學(xué)院，江西 贛州 341000）

為了研究間歇運(yùn)動(intermittent exercise)對腎上腺髓質(zhì)素受體活性修飾蛋白 2 (Receptor activity modifying protein，RAMP2)和降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)(兩者組成ADM特異性受體)基因表達(dá)的影響，探討腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)在間歇運(yùn)動誘導(dǎo)心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用機(jī)制。將SD大鼠30只，分為對照組(C組)，間歇運(yùn)動組(IE組)。IE組進(jìn)行3周的間歇跑臺運(yùn)動，應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測腎上腺髓質(zhì)素特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達(dá)。結(jié)果得到IE組大鼠RAMP2 mRNA和CRLR mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。說明間歇運(yùn)動上調(diào)ADM特異性受體的基因表達(dá)，可使心肌組織中ADM特異性受體的含量增加，ADM對于心臟的作用會因特異性受體的伴隨性上調(diào)而加強(qiáng)，這對于增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠狀動脈，使心肌功能及冠狀動脈血流量得以保證，在運(yùn)動中維持血液動力學(xué)穩(wěn)定和保護(hù)心肌細(xì)胞起重要的作用。

運(yùn)動生物化學(xué)；間歇運(yùn)動；腎上腺髓質(zhì)素；受體活性調(diào)節(jié)蛋白2；降鈣素受體樣受體；基因表達(dá)

間歇運(yùn)動(intermittent exercise)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用已被大多數(shù)的研究所認(rèn)可[1-7]，其機(jī)制與間歇運(yùn)動誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性，開放線粒體ATP敏感的鉀通道(mKATP)，改善心功能，減少心肌酶的漏出，減小心肌梗塞面積和危險(xiǎn)面積，降低心律失常發(fā)生率，減輕組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。研究表明，運(yùn)動預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)物質(zhì)與間歇運(yùn)動的心肌細(xì)胞保護(hù)關(guān)系最為密切，是研究的熱點(diǎn)。目前研究顯示，間歇運(yùn)動誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)物質(zhì)主要與以下3類物質(zhì)的改變有關(guān)：①抗氧化酶活性的提高；②應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生；③內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的合成和釋放。內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)主要集中在心血管的活性物質(zhì)。心血管活性物質(zhì)是一組對心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)具有重大影響的物質(zhì)，除包括支配心肌、血管的神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)外，還包括一些小分子物質(zhì)(NO、PG)；細(xì)胞因子和生長因子類以及心血管活性肽。心血管活性肽是該類物質(zhì)中成員最多、功能最復(fù)雜的一些短肽，在間歇運(yùn)動中起重要作用。主要包括：①腎素-血管緊張素系統(tǒng)；②內(nèi)皮素系統(tǒng)；③降鈣素/降鈣素基因相關(guān)肽超家族；④激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)和利尿鈉肽家族。其中大部分物質(zhì)在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中起的作用已經(jīng)被證實(shí)。這些物質(zhì)在間歇運(yùn)動誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)中是否也起到同樣的作用？盡管在降鈣素/降鈣素基因相關(guān)肽超家族中的降鈣素基因相關(guān)肽(配體)的作用已被孫曉娟，潘珊珊等[8]的研究證實(shí)，與其同一家族的腎上腺髓質(zhì)素(配體)也被李宏偉，潘珊珊等[9-10]的研究證實(shí)，但配體與受體結(jié)合才能發(fā)揮配體的作用，才能全面闡明保護(hù)機(jī)制，因此本研究在復(fù)制間歇運(yùn)動動物模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測腎上腺髓質(zhì)素特異性受體-腎上腺髓質(zhì)素受體活性修飾蛋白 2(receptor activity modifying protein，RAMP2)和降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)的基因表達(dá)，以全面闡明腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)在間歇運(yùn)動誘導(dǎo)心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

采用雄性健康SD大鼠40只，隨機(jī)分為對照組(C組)，間歇運(yùn)動組(IE組)。EP動物模型的運(yùn)動方案參照文獻(xiàn)[1-5，7]制定，即IE組大鼠以速度30 m/min，坡度為0°，持續(xù)時間為60 min，共3周的運(yùn)動負(fù)荷進(jìn)行跑臺訓(xùn)練。在60 min的間歇跑臺訓(xùn)練中，大鼠運(yùn)動15 min，休息5 min，重復(fù)3次。C組大鼠放在跑臺上

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件處理，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有顯著性。同樣時間，但不運(yùn)動。淘汰運(yùn)動能力差的大鼠。

1.2 取材

建模結(jié)束后，各組大鼠均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%戊巴比妥鈉(100 g體重1 mL)腹腔麻醉后，取仰臥位固定，打開胸腔，暴露心臟，從心尖處插入灌注針頭，緩慢注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%肝素2 mL，再快速滴注質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水400 mL，并迅速剪斷后腔靜脈。待生理鹽水滴完后，迅速取整心-80 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)

取100 mg大鼠心臟，用電動勻漿器進(jìn)行勻漿；兩相分離，RNA沉淀，RNA清洗，振蕩溶解，RNA沉淀。根據(jù) GenBank進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：GAPGH(內(nèi)參基因)CRLR、RAMP2的引物序列(表1)，制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板，針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置PCR反應(yīng)：95 ℃變性3 min；40個PCR循環(huán)(94℃ 20 s；59℃ 20 s；72℃ 30 s)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物為單一特異性擴(kuò)增條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7，1×10-8、1×10-9等梯度濃度的 DNA。這幾個梯度稀釋的 DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)溶液置于Light Cycler System熒光PCR儀(RG-3000，Roche Diagnostics，Switzerland)上進(jìn)行反應(yīng)。GAPDH：95℃ 5 min；35個PCR循環(huán)(95℃ 10 s；59℃ 15 s；72 ℃ 20 s；84 ℃(收集熒光)，5 s）；RAMP2：95 ℃ 5 min；40個 PCR 循環(huán)(95 ℃ 10 s；59 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s；85 ℃(收集熒光)，5 s)；CRLR：95 ℃ 5 min；40 個 PCR 循環(huán)(95 ℃ 10 s；59 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s；80 ℃(收集熒光)，5 s)。計(jì)算各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果及分析

各因子引物序列設(shè)計(jì)(表 1)、實(shí)時定量 PCR時各樣品加樣量均為1 μL，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的1 μL體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因 GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量(表 2)。

表1 各因子引物序列設(shè)計(jì)

表2 各組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA表達(dá)的變化(±s)

表2 各組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA表達(dá)的變化(±s)

1)與對照組比較，P<0.01；2)與對照組比較，P<0.01

組別 n/只 受體 基因的相對含量對照組 15 RAMP2 1.96±0.21 CRLR 9.75±0.041)CRLR 5.48±0.25運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組 15 PAMP2 5.84±0.312)

熒光定量RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，達(dá)到額定熒光閾值的循環(huán)次數(shù)(Ct)介于20～30次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推測CRLR mRNA及RAMP2 mRNA的起始拷貝數(shù)均在102～106，處于線性范圍內(nèi)。由表2可以看出，運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組大鼠CRLR mRNA及RAMP2 mRNA基礎(chǔ)表達(dá)量(以校正后的基因拷貝數(shù)的相對含量表示)顯著高于對照組(P<0.01)，提示運(yùn)動預(yù)適應(yīng)后，CRLR mRNA及RAMP2 mRNA基因表達(dá)水平上調(diào)。表明運(yùn)動預(yù)適應(yīng)提高了大鼠ADM特異性受體基因表達(dá)的調(diào)控能力。

3 討論

目前有多種受體可與ADM作用，主要有CGRP1受體和孤兒 G-蛋白偶聯(lián)受體(Orphan G protein coupling receptor，oGPCR)的RDC-1、L1及降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)等[11]。近年發(fā)現(xiàn) ADM受體表型不僅取決于受體本身結(jié)構(gòu)，還取決于一種受體活性修飾蛋白(Receptor activity modifying protein，RAMPs)的調(diào)控[12-13]，RAMPs有3個成員，即RAMP1、RAMP2、RAMP3，其中RAMP1與CRLR結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜成為功能性降鈣素基因相關(guān)肽受體(CGRPR)，而RAMP2與CRLR結(jié)合則為特異性ADM受體(RAMP2/CRLR)，RAMP3功能還不清楚?？梢姡琑AMP2與CRLR的同時變化才是ADM發(fā)揮作用的關(guān)鍵所在。

關(guān)于運(yùn)動對ADM特異性受體基因mRNA表達(dá)的研究非常有限。袁銘等[14]應(yīng)用Boster公司生產(chǎn)的ADM受體原位雜交試劑盒，探討 ADM受體的表達(dá)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞有ADM受體 mRNA的表達(dá)，但該實(shí)驗(yàn)未區(qū)分 RAMP2和 CRLR，因此特異性不強(qiáng)。賀杰等[15]讓SD大鼠無負(fù)重游泳適應(yīng)訓(xùn)練1周后進(jìn)行5周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，5次/周，50 min/次，以后的每周游泳訓(xùn)練遞增10 min，直至90 min/次，并保持此強(qiáng)度到訓(xùn)練結(jié)束。結(jié)果提示，長時期進(jìn)行低強(qiáng)度的有氧游泳訓(xùn)練能在不同程度上引起心臟RAMP2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，反映出長期低強(qiáng)度有氧運(yùn)動在分子水平上的良好適應(yīng)，而長時期進(jìn)行低強(qiáng)度有氧游泳訓(xùn)練對主動脈的影響是RAMP2 mRNA表達(dá)無顯著變化，但該實(shí)驗(yàn)沒有同時測定CRLR，因此不能全面反映ADM特異性受體的調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時熒光定量 PCR對ADM的特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達(dá)同時進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，間歇運(yùn)動同時上調(diào) ADM的特異性受體RAMP2和CRLR的基因表達(dá)，說明間歇運(yùn)動促使心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放ADM作用于心肌局部，同時通過上調(diào)RAMP2和CRLR的基因表達(dá)，上調(diào)RAMP2和CRLR，然后作用于心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮其調(diào)節(jié)心血管功能的作用及在運(yùn)動中維持血液動力學(xué)穩(wěn)定和保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。

研究表明，心肌受到傷害性刺激后，如缺血、缺氧，機(jī)械壓性應(yīng)力增強(qiáng)、心肌細(xì)胞的伸長，炎性因子如白細(xì)胞介素-1、腫瘤干擾因子、脂多糖、血管緊張素-Ⅱ、內(nèi)皮素-1等分泌增加，ADM mRNA表達(dá)顯著增加。這些因素同樣也可以使心肌細(xì)胞上的 ADM受體發(fā)生質(zhì)和量的變化稱為 ADM受體調(diào)節(jié)，受體調(diào)節(jié)可以使心肌更好地適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化，但如受體反應(yīng)性減弱可保護(hù)細(xì)胞免受過量或長期刺激而導(dǎo)致生理功能紊亂，但受體過度則又會引起一系列病理性后果。大強(qiáng)度運(yùn)動是一種傷害性刺激，可以顯著提高交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)活動，極大增加心率和血壓，造成血流動力學(xué)穩(wěn)態(tài)失衡，心肌發(fā)生缺血缺氧，進(jìn)而可能發(fā)生心肌頓抑，甚至心源性運(yùn)動猝死。因此，機(jī)體為了抵御這種損傷調(diào)動了各種機(jī)制，間歇運(yùn)動是其中重要的機(jī)制之一。間歇運(yùn)動實(shí)施心臟保護(hù)主要是通過調(diào)動和激發(fā)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，間歇運(yùn)動的刺激能顯著啟動心臟CRLR和RAMP2的基因轉(zhuǎn)錄，或者說引起心臟 CRLR mRNA和RAMP2 mRNA量的積累，因而可對心肌組織中CRLR和RAMP2 含量會有顯著影響。經(jīng)過間歇運(yùn)動訓(xùn)練后，心臟CRLR mRNA和RAMP2 mRNA表達(dá)上調(diào)可使心肌組織中CRLR和RAMP2含量增加。同時ADM對于心肌的作用可能會因?yàn)镃RLR和RAMP2的伴隨性上調(diào)而加強(qiáng)。在EP中ADM增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠狀動脈，這樣使心肌功能及冠狀動脈血流量得到保證。ADM對心臟的作用必須通過和心臟相應(yīng)的 ADM特異性受體結(jié)合并通過受體的調(diào)節(jié)來完成。本實(shí)驗(yàn) CRLR mRNA和 RAMP2 mRNA上行調(diào)節(jié)的結(jié)果提高了心臟局部的ADM 的水平，增強(qiáng)ADM對心臟的作用。間歇運(yùn)動刺激的ADM受體正向調(diào)節(jié)作用是適度的反應(yīng)性增強(qiáng)調(diào)節(jié)，能增強(qiáng)心臟對運(yùn)動的適應(yīng)，如運(yùn)動的強(qiáng)度或方式的改變可能會導(dǎo)致調(diào)節(jié)過度或受體失敏。這從另一個側(cè)面反映了間歇運(yùn)動對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是機(jī)體對間歇運(yùn)動這種運(yùn)動形式產(chǎn)生了良好的生物學(xué)適應(yīng)。

間歇運(yùn)動上調(diào)ADM特異性受體CRLR和RAMP2的基因表達(dá)，可使心肌組織中CRLR和RAMP2的含量增加，ADM對于心臟的作用會因CRLR和RAMP2的伴隨性上調(diào)而加強(qiáng)，這對于增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張冠狀動脈，使心肌功能及冠狀動脈血流量得到保證，在運(yùn)動中維持血液動力學(xué)穩(wěn)定和保護(hù)心肌細(xì)胞起重要的作用。

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Effects of intermittent exercising on the gene expression of particular adrenal medullarin receptors

LI Hong-wei
（School of Physical Education，Gannan Normal University，Ganzhou 341000，China）

In order to study the effects of intermittent exercising on the gene expression of adrenal medullarin(ADM) receptor activity modifying protein 2 (RAMP2) and calcitonin receptor like receptors (CRLR), which constitute particular ADM receptors, and to explore the functioning mechanism of ADM in intermittent exercising inducing cardiac muscle cell protection, the authors divided 30 SD rates into a control group (group C) and an intermittent exercising group (group IE), let the rats in group IE do a 3-week intermittent treadmill exercise, applied real time fluorescent quantified reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to test the expression of particular ADM receptors RAMP2 and CRLR, and revealed that the levels of expression of RAMP2 mRNA and CRLR mRNA of the rats in group IE increased significantly, which indicates that intermittent exercising increases the gene expression of particular ADM receptors, can increase the contents of particular ADM receptors in cardiac muscle tissues, and that the functions of ADM on the heart are enhanced by the increase of particular receptors, which plays an important role in strengthening cardiac muscle contraction, dilating coronary arteries, ensuring cardiac muscle functions and coronary artery blood flow, as well as maintaining hemodynamic stability and protecting cardiac muscle cells during exercising.

sports biochemistry；intermittent exercise；adrenal medullarin；receptor activity modifying protein 2；calcitonin receptor like receptor；gene expression

G804.7

A

1006-7116(2010)10-0105-04

2010-03-29

李宏偉（1969-），男，副教授，博士，研究方向：運(yùn)動醫(yī)學(xué)。