王云龍 ，陳曉輝 ，許世偉 ，邵禮梅 ，李延雪

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；2.雞西市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江雞西 158100）

元胡止痛片為《中國藥典》2005年版一部品種，由延胡索（醋制）與白芷兩味中藥組成，具有理氣、活血、止痛的功效。歐前胡素、延胡索乙素、異歐前胡素均是元胡止痛片中的有效成分。目前，現(xiàn)版藥典[1]僅對(duì)其中的延胡索乙素進(jìn)行了質(zhì)量控制，文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]的大多是對(duì)其一種或兩種成分進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)測(cè)定元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素、異歐前胡素的含量的方法未見報(bào)道。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素與異歐前胡素的含量，方法簡便、快速、專屬性強(qiáng)、分離度高，可作為元胡止痛片的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100高效液相色譜儀（四元泵、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、HP Chemstation色譜工作站）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；AG285 電子分析天平。

1.2 試藥

延胡索對(duì)照品、歐前胡素對(duì)照品和異歐前胡素對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；水為雙重蒸餾水，甲醇為色譜純；元胡止痛片由四川蜀中制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.5）（61∶39）；檢測(cè)波長：280 nm；流速：1.0 ml/min。柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素4.74、2.05、7.50 mg，置 100 ml量瓶中，加甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取元胡止痛片20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約10片重，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，精密加入加濃氨試液-甲醇溶液（1∶20）50 ml，稱定重量，冷浸 1 h，加熱回流 1 h，放冷，稱定重量，用濃氨試液-甲醇溶液（1∶20）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素混合對(duì)照品溶液 3、5、7、9、11、13 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明歐前胡素在0.047 4～0.284 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=3×106±+1.22×104（r=0.999 9）；延胡索乙素在0.020 5～0.123 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=4×106±+1.46×104（r=0.999 8）；異歐前胡素在0.075 0～0.450 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=2×106±-1.48×104（r=1.000 0）。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 10 μl，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=1.5%，延胡索乙素的RSD=0.3%，異歐前胡素的RSD=1.8%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于放置 0、2、4、6、8 h 后，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=0.4%，延胡索乙素的RSD=1.3%，異歐前胡素的RSD=0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，在上述色譜條件下分別測(cè)定色譜峰面積，歐前胡素的RSD=1.6%，延胡索乙素的RSD=1.9%，異歐前胡素的RSD=2.1%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品5份，每份20片，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密量取5 ml置5個(gè)25 ml量瓶中，分別精密加入上述混合對(duì)照品溶液5 ml，在上述色譜條件下測(cè)定，進(jìn)樣量20 μl，計(jì)算回收率，歐前胡素的平均回收率為98.6%，RSD=0.7%；延胡索乙素的平均回收率為97.5%，RSD=0.2%；異歐前胡素的平均回收率為96.8%，RSD=1.1%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of recovery test(n=5)

2.10 樣品測(cè)定

取5批樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算相應(yīng)元胡止痛片中歐前胡素、延胡索乙素和異歐前胡素的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=5）Tab.2 Content determination results of samples(%,n=5)

4 討論

4.1 提取方法選擇

本研究比較了超聲提取法與回流提取法對(duì)歐前胡素與異歐前胡素提出率的影響［5-6］，回流提取法延胡索乙素含量高于超聲提取法延胡索乙素含量，歐前胡素與異歐前胡素含量無明顯差異，故采用回流提取法。

4.2 色譜條件的選擇

對(duì)流動(dòng)相甲醇與水的比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明當(dāng)甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（80∶20）、甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（70∶30）時(shí)，延胡索乙素、歐前胡素與異歐前胡素與其他組分分離效果不好，甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH值至 6.5）（50∶50）洗脫時(shí)間較長，甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.5）（61∶39）延胡索乙素、歐前胡素與異歐前胡素與其他組分分離效果良好，保留時(shí)間適宜，故選擇作為流動(dòng)相，柱溫分別考察了25℃、30℃、35℃，結(jié)果表明35℃時(shí)柱壓較小，分離效果好。

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:363.

[2]陳洪寶,李彩榮,楊慶勝,等.高效液相色譜法測(cè)定元胡止痛片中延胡索乙素的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,(9):1701-1702.

[3]孫巍,竇志英,高瓔.HPLC法同時(shí)測(cè)定元胡止痛片中3種有效成分的含量[J].天津中醫(yī)藥,2006,23(5):426-428.

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[5]周岐?jiǎng)?李健和,徐幸民.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸甲氯芬酯分散片含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(4):73-76.

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