袁曉宇，許文濤，黃昆侖，羅云波，谷新晰，田洪濤,,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

Nisin-rbLF-N融合基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)

袁曉宇1，許文濤2，黃昆侖2，羅云波2，谷新晰1，田洪濤1,2,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

針對(duì)乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點(diǎn)，選擇對(duì)抗菌譜較廣且具有較強(qiáng)抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構(gòu)建融合基因Nisin-rbLF-N。將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T1中，轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳及抑菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明，克隆菌經(jīng)誘導(dǎo)后可表達(dá)出可觀的融合蛋白，融合蛋白以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)洗滌、尿素溶解、復(fù)性后具有抗菌生物活性。

融合基因；誘導(dǎo)表達(dá)；抑菌活性

Abstract ：Considering that Nisin has a narrow antibacterial spectrum, rbLF-N with strong inhibitory activity against a wide range of bacteria was used to construct fusion gene Nisin-rbLF-N. The fusion gene was cloned into the expression vector pGEX-4T1, followed by transformation into the E. coli BL21 prokaryotic expression system for protein expression under IPTG induction.The expressed protein encoded by Nisin- rbLF-N gene was detected by Tricine-SDS-PAGE protein electrophoresis and it inhibitory activities against Gram positive and negative bacteria were also assayed. A considerable amount of fusion protein was expressed in E. coli BL21 cells and the protein was mainly found in inclusion bodies. The product obtained from the inclusion bodies subjected to washing, dissolution in 8 mol/L urea and protein refolding had good inhibitory activity against Gram positive bacteria rather than their negative counterparts.

Key words：fusion gene；inducible expression；antibacterial activity

乳鏈菌肽(nisin)又稱乳酸鏈球菌素、尼生素等，它是由乳酸乳球菌某些菌株生長過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。對(duì)食品傳播的病原菌和腐敗微生物有強(qiáng)的抑制作用[1]。食用后的Nisin在人體的生理pH值條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其他抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會(huì)與其他抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、性能卓越的天然食品防腐劑[2-3]。Nisin應(yīng)用前景廣闊，但存在局限性，它只具有G+菌抗性，而不能抑制食品中許多G－致病菌[4-5]，因此擴(kuò)大Nisin抗菌譜的研究不僅具有理論價(jià)值，而且具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一段多肽，廣泛存在于動(dòng)物的多種組織中[6-7]。具有抗菌、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物功能，在眾多的功能中，抗菌功能是最引人注目的。乳鐵蛋白活性多肽具有廣譜抗菌性，對(duì)G+菌、G－菌、酵母菌、真菌等均有抗性，其中牛乳鐵蛋白N端多肽(rbLF-N)的抗菌活性較其他的乳鐵蛋白肽活性高，具有很好的應(yīng)用前景[8-10]。

本研究針對(duì)Nisin抑菌譜窄的缺點(diǎn)及對(duì)rbLF-N的眾多優(yōu)點(diǎn)的考慮，選擇對(duì)抗菌譜較廣且具有較強(qiáng)抗性的rbLF-N為材料，構(gòu)建Nisin-rbLF-N融合基因，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，嘗試獲得具有更強(qiáng)G+菌抗性和G－菌抗性的融合蛋白，以期為進(jìn)一步構(gòu)建性能優(yōu)良的融合抗菌蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮牛肉購自北京市牛街清真市場。

1.2 表達(dá)載體與菌株

pGEM-T easy質(zhì)粒 大連TaKaRa生物工程有限公司；pGEX-4T1表達(dá)質(zhì)粒 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營養(yǎng)工程生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌E. coli DH5α、BL21(DE3)感受態(tài) 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；干酪乳桿菌、大腸桿菌E. coli 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 工具酶與試劑

BamHⅠ和 EcoRⅠ酶制劑 NEB(北京)公司；T4連接酶 Promage公司；DNA Marker DL2000和DNA回收試劑盒 北京Tiangen生化科技有限公司；Tris-base、EDTA、X-Gal、IPTG、氨芐青霉素 Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；引物由TaKaRa生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 儀器與設(shè)備

20G高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、20G高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；LRH-150B型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；DYY-III31A/31B型電泳槽、DYY-III2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；THZ-C型空氣浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SX-300型凝膠成像系統(tǒng) 上海小源科技有限公司；REVCO超低溫冰箱(－80℃) 美國來亨公司。

1.5 方法

1.5.1 Nisin基因優(yōu)化及引物合成

根據(jù)Genebank公布的Nisin基因序列及蛋白序列，為使目的基因獲得穩(wěn)定表達(dá)，用適于在BL21中表達(dá)的密碼子代替那些不適合于在其中表達(dá)的密碼子優(yōu)化Nisin基因[11]，并在5＇端和3＇端設(shè)計(jì)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的Nisin基因序列由寶生物合成克隆于pMD19-T載體。根據(jù)目的序列分別設(shè)計(jì)引物，上游引物F1：5＇-CGGGATCC ATGAGCACCAAAGAT-3＇；下游引物R1：5＇-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3＇。由上海生工生物工程有限公司合成。在上游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(下劃線標(biāo)記)和保護(hù)堿基。

1.5.2 提取牛肉總DNA、引物合成

從牛肉中提取總DNA的方法參照文獻(xiàn)[12]，根據(jù)GenBank (Original accession number：NM180998) 已知的牛乳鐵蛋白cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物F2：5＇-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3＇；下游引物R2：5＇-CGGAATTC TTACCGGATAC ATGCCAAGGC-3＇，由上海生工生物工程有限公司合成。在上游引物設(shè)計(jì)與Nisin互補(bǔ)配對(duì)的序列(下劃線標(biāo)記)，下游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)BamHⅠ(下劃線標(biāo)記)、終止密碼子和保護(hù)堿基。

1.5.3 重組質(zhì)粒pGEM-T easy/Nisin- rbLF-N的構(gòu)建與鑒定

以合成的pMD19-T/Nisin質(zhì)粒為模板，用引物F1、R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增Nisin基因?yàn)?79bp，PCR產(chǎn)物純化回收；以提取牛肉總DNA為模板，用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增rbLF-N基因?yàn)?81bp，PCR產(chǎn)物純化回收；以純化回收后的Nisin基因和rbLF-N基因?yàn)槟０?，用引物F1、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Nisin-rbLF-N融合基因約為336bp，PCR產(chǎn)物純化回收后與pGEM-T easy載體連接，并轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，用PCR及EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。PCR參數(shù)為：95℃、4min，94℃、30s；退火溫度58℃、60s，延伸72℃、30s，35個(gè)循環(huán)、72℃保溫10min。

1.5.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1/Nisin-rbLF-N和基因工程菌的構(gòu)建

用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pGEM-T easy/NisinrbLF-N質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收NisinrbLF-N片段，并將其連接到以同樣酶切割的載體pGEX-4T1上，構(gòu)建表達(dá)載體，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1/Nisin-rbLF-N轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，構(gòu)建基因工程菌株。插入pGEX-4T1中的Nisin-rbLF-N基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5.5 Nisin-rbLF-N融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)[13-15]

挑取含有重組質(zhì)粒的BL21(DE3)白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)5%接種于LB液體培養(yǎng)中于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)直至菌液OD600nm值達(dá)0.6～0.8時(shí)；加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h；將菌液離心(5000×g，離心10min)收集菌體與pH7.3的0.01mol/L PBS緩沖液中超聲破碎7s，間隔10s，共15次。于4℃、2000×g離心15min，棄去沉淀(基本為菌體和碎片)，上清液于12000×g離心30min，收集沉淀(包涵體)。

1.5.6 表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性及抗菌活性的初步檢測(cè)

將收集的包涵體用8mol/L尿素溶解，采用濃度梯度透析復(fù)性[16]。復(fù)性透析溶液Ⅰ至Ⅵ分別是6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素與20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl溶液配制的pH8.0溶液，每一溶液透析復(fù)性8h，復(fù)性后溶液于5000×g離心20min收集上清。測(cè)試菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的干酪乳桿菌和大腸桿菌，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的獲得和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

以合成的pMD19-T/Nisin質(zhì)粒為模板，用引物F1、R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增Nisin基因片段，以提取牛肉總DNA為模板，用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增rbLF-N基因片段(圖1)。以純化回收后的Nisin基因片段和rbLF-N基因片段為模板，用引物F1、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增Nisin-rbLF-N融合基因片段(圖2)。由圖1可以看出，在靠近250bp附近有兩條亮帶，大小與欲擴(kuò)增的目的基因片段相符(Nisin基因?yàn)?79bp，rbLF-N基因?yàn)?81bp)。由圖2可以看出，在靠近500bp附近有一條亮帶，測(cè)序結(jié)果證明與欲擴(kuò)增的目的基因片段(336bp)的序列相吻合，其編碼的氨基酸閱讀框不變。

圖1 目的基因PCR產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoretic patterns of PCR products of the target gene

圖2 重組質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoretic patterns of PCR products of recombinant plasmid pGEX-4T containing Nisin-rbLF-N gene digested by EcoRⅠand BamHⅠtogether

2.2 重組融合蛋白的表達(dá)

Nisin-rbLF-N基因全長336bp，加上谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼區(qū)，重組蛋白由333個(gè)氨基酸構(gòu)成。工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Nisin-rbLF-N基因得到了高效表達(dá)，菌體總蛋白中出現(xiàn)了分子質(zhì)量約為38kD的重組融合蛋白(圖3)，并且融合蛋白的表達(dá)量占到菌體蛋白總量的25.3%，產(chǎn)率為1.63g/L。菌體經(jīng)超聲破碎、離心、Tricine-SDS-PAGE分析[17]發(fā)現(xiàn)，Nisin-rbLF-N-GST重組融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖3 GST-Nisin- rbLF-N融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE patterns showing the heterologous expression of GST-Nisin- rbLF-N fusion protein in E. coli BL21 (DE3)

2.3 重組蛋白的復(fù)性及抗菌活性的初步檢測(cè)

將離心得到的包涵體用8mol/L尿素溶解，最終質(zhì)量濃度為0.2g/L，采用濃度梯度透析復(fù)性。由圖3可以看出，復(fù)性后的上清液中含有目的蛋白(箭頭表示)，但復(fù)性率僅為13.32%，融合蛋白含量為0.027g/L。取復(fù)性后上清液，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌活性，測(cè)試菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的干酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌(G－菌)，抗菌活性見圖4、5。抑菌活性檢測(cè)表明，Nisin-rbLF-NGST融合蛋白具有革蘭氏陽性菌抗性，但沒有革蘭氏陰性菌抗性。

圖4 融合蛋白對(duì)G+菌的抑菌活性Fig.4 Inhibitory effect of GST-Nisin-rbLF-N fusion protein on Gram positive bacteria

圖5 融合蛋白對(duì)G－菌的抑菌活性Fig.5 Noninhibitory effect of GST-Nisin-rbLF-N fusion protein on Gram negative bacteria

3 討 論

Nisin是目前國際上最為看好和應(yīng)用效果最好的微生物型天然食品防腐劑，但也存在局限性，如不能夠抑制G－、酵母菌以及霉菌，在中性及堿性環(huán)境中溶解度低、不穩(wěn)定而且抗菌效果大大降低等[2-3]，而且由于Nisin復(fù)雜的翻譯后加工及其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，單純對(duì)其基因進(jìn)行改造以擴(kuò)大其抗菌譜及提高其活性難度較大。因此嘗試通過構(gòu)建融合基因來擴(kuò)大Nisin的抗菌譜，得到同時(shí)抗G－菌和G+菌的融合蛋白，并將其在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，以期獲得廣譜的重組蛋白生產(chǎn)菌株。

rbLF-N具有廣譜抗菌性，對(duì)G+菌、G－菌、酵母菌、真菌等均有抗性，并且因?yàn)閞bLF-N來源于動(dòng)物本身，具有傳統(tǒng)抗生素沒有的作用效果，而且它不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，也不會(huì)殘留于產(chǎn)品中，加之其物化性質(zhì)和生物學(xué)活性獨(dú)特，是一種健康安全的產(chǎn)品[6-8]。

本研究將Nisin基因與rbLF-N基因相連，考慮到Nisin復(fù)雜的成熟過程，在設(shè)計(jì)融合基因時(shí)，將Nisin設(shè)計(jì)在融合基因的N端，得到融合基因Nisin-rbLF-N，連接到克隆載體上，經(jīng)過雙酶切目的片段連接到表達(dá)載體pGEX-4T1上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。選用的pEGX-4T1質(zhì)粒是表達(dá)GST融合蛋白的大腸桿菌高效表達(dá)載體，選擇該載體的主要原因是：1)含有非常強(qiáng)的tac啟動(dòng)子，IPTG可誘導(dǎo)目的基因的高效表達(dá)；2)表達(dá)產(chǎn)物利于分離純化：融合蛋白可通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)親和層析純化，溫和的抽提條件對(duì)融合蛋白的抗原性和功能活性影響極小，再用凝血酶或Xa因子將GST切除，可方便地獲得目的蛋白[8]。

大腸桿菌是目前最常用的外源蛋白表達(dá)菌株，容易培養(yǎng)、生長迅速、周期短，成本低，以及有大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體，成為人們克隆表達(dá)外源基因的主要菌株。但表達(dá)的蛋白多以包涵體形式存在，包涵體是具有膜結(jié)構(gòu)的非結(jié)晶性蛋白質(zhì)聚集體，無生物活性。因此需要用變性劑對(duì)包涵體進(jìn)行處理，在適當(dāng)?shù)臈l件下使它經(jīng)過變性/復(fù)性才能具有天然結(jié)構(gòu)和活性。本研究采用濃度梯度透析法對(duì)融合蛋白包涵體進(jìn)行了體外復(fù)性，經(jīng)復(fù)性后的融合蛋白進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，結(jié)果表明Nisin- rbLF-N-GST融合蛋白只具有革蘭氏陽性菌抗性，但沒有革蘭氏陰性菌抗性，分析產(chǎn)生這樣的原因可能有：一是復(fù)性率低，僅為13.32%，目的融合蛋白含量減少到0.027g/L，這對(duì)抑菌的效果產(chǎn)生了很大影響，因此有必要對(duì)Nisin-rbLF-N-GST融合蛋白復(fù)性條件(蛋白的初始質(zhì)量濃度、pH值、溫度、尿素濃度)的優(yōu)化做進(jìn)一步研究，減少目的融合蛋白的損失，同時(shí)嘗試將融合基因Nisin-rbLF-N轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行可溶性表達(dá)；二是復(fù)性可能造成目的融合蛋白的功能損失，要對(duì)如何減少或避免因復(fù)性造成功能損失做進(jìn)一步研究，如在復(fù)性溶液中加入低分子質(zhì)量的還原和氧化的含硫基化合物，提供合適的氧化還原電位，幫助二硫鍵的正確形成。

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Construction of Nisin-rbLF-N Fusion Gene and Its Expression in Escherichia coli

YUAN Xiao-yu1，XU Wen-tao2，HUANG Kun-lun2，LUO Yun-bo2，GU Xin-xi1，TIAN Hong-tao1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Q786

A

1002-6630(2010)15-0194-04

2009-10-05

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z440)；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2007-Z8)

袁曉宇(1982—)，女，碩士，研究方向?yàn)橐嫔拈_發(fā)利用。E-mail：yuanxiaoyu168521@yahoo.com.cn

*通信作者：田洪濤(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：cauxwt@yahoo.cn