白承之， 王轉(zhuǎn)花*， 李玉英

(化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

一種苦蕎抗真菌肽的純化及抑菌活性分析

白承之， 王轉(zhuǎn)花*， 李玉英

(化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

以苦蕎種子為材料，經(jīng)提取、熱處理，Resource S陽(yáng)離子交換層析及Superdex Peptide分子篩層析，純化具有抗真菌活性的多肽。Tricine-SDS-PAGE分析表明，該多肽的表觀分子質(zhì)量約為8.0kD。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF)顯示其實(shí)際分子質(zhì)量為3.909kD。該抗菌肽對(duì)白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和鏈格孢霉(Alternaria alternata)均表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)抑制活性。綠色木霉的形態(tài)學(xué)分析顯示：受到苦蕎抗真菌肽影響的菌絲生長(zhǎng)停滯，分支加劇，基內(nèi)菌絲端部膨大，原生質(zhì)凝縮。該抗真菌肽的制備工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好，抑菌作用明顯。

苦蕎；抗真菌肽；純化；抑菌活性；形態(tài)學(xué)分析；熱穩(wěn)定性

Abstract ：An antifungal peptide (AFP) having the ability to protect organisms against fungal invasion was isolated from tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) seeds. The purification procedure involved extraction with 20 mmol/L Tris-HCl buffer, heating treatment, Resource S cation exchange column chromatography, and size exclusion chromatography (SEC) on Superdex peptide column. The apparent molecular weight of the purified peptide was approximately 8.0 kD evaluated by Tricine-SDS-PAGE, and its actual molecular weight was 3.909 kD determined by surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight (SELDI-TOF). This peptide showed strong antifungal activity against Panus conchatus, Trichoderma reesei and Alternaria alternate and could cause swelling hyphal tips, hyphal distortion and condensed protoplasm in Trichoderma reesei. The easy preparation, high thermal stability and potent antifungal activity of this antifungal peptide demonstrate its great potential in food industry.

Key words ：tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum)；antifungal peptide；purification；antifungal activity；light microscopic examination；thermal stability

在過(guò)去的數(shù)十年中，來(lái)自于細(xì)菌、真菌(酵母，霉菌或可食用真菌)[1-2]、高等植物(豆科和非豆科來(lái)源的植物種子)[3]、無(wú)脊椎動(dòng)物(家蠅)、低等脊椎動(dòng)物(蟾)[4]、哺乳動(dòng)物和人類的抗真菌蛋白或抗真菌肽(antifungal proteins and peptides，AFPs)陸續(xù)被純化和鑒定。AFPs是具有真菌生長(zhǎng)抑制活性的一系列蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱，分子質(zhì)量在10kD以上的習(xí)慣稱為抗真菌蛋白，已知的有幾丁質(zhì)酶、類幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑、核糖體失活蛋白[5]等；而分子質(zhì)量小于10kD的稱為抗真菌肽，可能為脂轉(zhuǎn)運(yùn)肽[6]、類防御素肽或無(wú)其他生物活性的抗真菌肽。來(lái)源于高等植物的抗真菌肽尤其受到關(guān)注，因?yàn)檫@類抗真菌肽一般具有來(lái)源廣泛，抗菌譜廣[7]，熱穩(wěn)定性高[8]等優(yōu)點(diǎn)，在未來(lái)的農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)有潛在的利用前景。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)含有豐富的生物活性成分，目前研究報(bào)道較多的是其中的生物類黃酮、抗?fàn)I養(yǎng)因子及過(guò)敏性成分等[9]，有關(guān)蕎麥抗真菌肽僅見(jiàn)Leung 等[10]報(bào)道的一種來(lái)自甜蕎種子中的抗真菌肽。本實(shí)驗(yàn)以苦蕎為材料，提取、純化抗真菌肽，并對(duì)其分子特征、抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌種與儀器

苦蕎為貴州威黑蕎，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。

所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

鏈格孢霉(Alternaria alternata)、白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)由山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。

Resource S離子交換層析柱、Superdex Peptide HR10/300排阻層析柱 GE Healthcare公司；表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF) Ciphergen公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎種子抗真菌肽的純化

2008年收獲的苦蕎種子經(jīng)過(guò)低溫干燥處理，于粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)0.2mm孔徑篩網(wǎng)，以3:1(V/m)的比例加入丙酮，在低溫條件下攪拌脫脂3h。減壓抽濾，棄丙酮，收集濾餅，加入少量乙醚攪拌，減壓抽濾，棄乙醚，收集濾餅，低溫下干燥，所得粉末為苦蕎種子脫脂粉。

取苦蕎種子脫脂粉，以10:1(V/m)的比例加入浸提緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0)，在4℃條件下攪拌浸提6h，12000×g離心棄沉淀，在上清中加入硫酸銨至80%飽和度，4℃條件下攪拌鹽析3h，12000×g離心棄上清，沉淀用浸提緩沖液溶解，并用截留分子質(zhì)量為3kD的透析袋充分透析，所得蛋白溶液為苦蕎種子水溶性總蛋白。

取上述水溶性總蛋白，在80℃恒溫水浴中熱處理20min，12000×g離心，除去熱不穩(wěn)定的雜蛋白，收集上清液中對(duì)熱穩(wěn)定的目的蛋白，進(jìn)一步采用離子交換層析和分子篩層析在AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)上分離。經(jīng)過(guò)熱處理的苦蕎種子水溶性總蛋白，用Resource S陽(yáng)離子交換層析平衡緩沖液充分透析后，上樣于Resource S陽(yáng)離子交換柱(1mL)。平衡緩沖液條件：20mmol/L NH4OAc pH4.5，洗脫緩沖液條件：20mmol/L NH4OAc，1mol/L NaCl，pH4.5，流速為0.5mL/min，待穿透峰被完全洗脫之后，設(shè)置40mmol/L NaCl的不連續(xù)梯度洗脫。收集各洗脫峰，進(jìn)行抗真菌活性的篩選。

收集到的活性組分用分子篩層析的平衡緩沖液(20mmol/L Tris-HCl 150mmol/L NaCl pH8.0)充分透析，上樣于Superdex Peptide HR 10/300層析柱，流速為0.5mL/min，收集活性洗脫峰。

1.2.2 分子質(zhì)量測(cè)定

分子篩層析獲得的活性組分使用Tricine-SDS-PAGE[11]進(jìn)行分子質(zhì)量估計(jì)和純度鑒定，4%濃縮膠，16.5%分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并在凝膠成像系統(tǒng)中使用GeneTools software軟件進(jìn)行純度分析。

為了得到苦蕎種子抗真菌肽準(zhǔn)確的分子質(zhì)量，排阻層析獲得的活性組分，使用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF)進(jìn)行分子量測(cè)定[12]，使用CM-10(弱陽(yáng)離子交換芯片)進(jìn)行蛋白質(zhì)吸附，結(jié)果使用Ciphergen ProteinChip Software進(jìn)行分析。

1.2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察

選擇綠色木霉(Trichoderma reesei)、鏈格孢霉(Alternaria alternata)和白腐菌(Panus conchatus)為受檢真菌，使用牛津杯法[13]檢測(cè)各層析組分對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用。具體方法為：準(zhǔn)備PDA培養(yǎng)基平板，將供試霉菌點(diǎn)植于培養(yǎng)基中心，于28℃培養(yǎng)至霉菌菌落直徑達(dá)到1～2cm，在菌落外圍放置滅菌的牛津杯，距離菌落邊緣1cm，樣品組(含目的蛋白)和對(duì)照組(不含目的蛋白而其他條件完全相同的緩沖液)各取200μL，使用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，加入牛津杯內(nèi)，在4℃預(yù)擴(kuò)散24h，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。將樣品組和對(duì)照組的菌絲直接置于倒置顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎種子抗真菌肽的純化

圖1 苦蕎種子抗真菌肽的Resource S陽(yáng)離子交換層析Fig.1 Resource S cation exchange column fractionization of hydrolysates of thermal treated water-soluble proteins from tartary buckwheat

圖2 陽(yáng)離子交換層析活性洗脫峰Ⅳ的Superdex Peptide HR 10/300凝膠排阻層析Fig.2 Size exclusion chromatographic profile of fraction IV obtained in resource S cation exchange column fractionization on Superdex Peptide HR 10/300 column

苦蕎種子水溶性總蛋白經(jīng)過(guò)80℃恒溫水浴20min，離心棄沉淀，上樣于Resource S陽(yáng)離子交換柱，獲得4個(gè)層析峰(圖1)，僅有峰IV顯示出抗真菌活性，將峰IV上樣于Superdex Peptide HR 10/300分子篩層析柱，得到一個(gè)單峰(圖2峰I)，抑菌實(shí)驗(yàn)顯示該峰具有抗真菌活性。

2.2 分子質(zhì)量測(cè)定

圖3 苦蕎種子抗真菌肽的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 Tricine-SDS-PAGE of the purified antifungal peptide and watersoluble proteins from tartary buckwheat

圖3顯示，經(jīng)過(guò)熱處理以及兩步層析，目的多肽得到了高度純化，其在電泳過(guò)程中的表觀分子質(zhì)量約為8.0kD，使用GeneTools software軟件灰度掃描分析可知，表達(dá)產(chǎn)物的純度均達(dá)到95%以上。

圖4 苦蕎種子抗真菌肽的SELDI-TOFFig.4 SELDI-TOF mass spectrum of the purified antifungal peptide

質(zhì)譜結(jié)果顯示該多肽的實(shí)際分子質(zhì)量為3.909kD(圖4)，該結(jié)果與目的多肽在Superdex Peptide HR 10/300 分子篩層析結(jié)果(圖2)一致。

2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察

圖5顯示，3株供試霉菌在目的多肽的作用下，均受到顯著的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)于鏈格孢霉和白腐菌，抗菌肽會(huì)造成菌落邊緣形成類似弦月的抑制形態(tài)。對(duì)于依靠孢子增殖的綠色木霉而言，菌絲可以繞過(guò)抑制區(qū)繼續(xù)擴(kuò)散，抑制區(qū)的菌落會(huì)形成一個(gè)類似抑菌圈的抑制形態(tài)，而對(duì)照組的菌落邊緣為規(guī)則的圓形，顯示沒(méi)有任何生長(zhǎng)抑制。

圖5 苦蕎種子抗真菌肽對(duì)3株真菌生長(zhǎng)抑制作用的定性實(shí)驗(yàn)Fig.5 Antifungal activity of the purified antifungal peptide against three species of fungi

為了進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)獲得的苦蕎抗真菌肽的抑菌作用，選擇綠色木霉平板在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。如圖6所示，抗真菌肽可以顯著抑制綠色木霉的生長(zhǎng)，與對(duì)照組(A)相比，樣品組(B)菌絲生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)停滯, 頂端分支加劇，菌落形成清晰界面；樣品組(D)與對(duì)照組(C)相比則出現(xiàn)基內(nèi)菌絲端部膨大，出現(xiàn)泡狀物，樣品組(E)顯示菌絲原生質(zhì)凝縮，呈現(xiàn)出片段化特征，而對(duì)照組(C)菌絲光滑，均勻，形態(tài)正常，未出現(xiàn)生長(zhǎng)受到抑制的形態(tài)特征。

圖6 苦蕎種子抗真菌肽對(duì)綠色木霉生長(zhǎng)抑制作用的形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Light microscopic examination of the purified antifungal activity against Trichoderma reesei

3 討 論

在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)領(lǐng)域，腐生絲狀真菌(霉菌)的污染始終是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。多種農(nóng)藥以及食品防腐劑因?yàn)椴环闲碌氖称钒踩蠖Ｖ故褂茫瑫r(shí)，抗真菌肽因其來(lái)源廣泛、抗菌譜廣、對(duì)人無(wú)毒、對(duì)環(huán)境無(wú)公害的特征越來(lái)越得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。和抗真菌蛋白相比，抗真菌肽具有熱穩(wěn)定性好、不致敏等特點(diǎn)，在食品工業(yè)的應(yīng)用潛力巨大。多種植物種子來(lái)源的抗真菌肽已經(jīng)得到純化和鑒定[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)小雜糧作物——苦蕎為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換層析和分子篩層析兩步層析純化，分離得到純度較高的苦蕎種子抗真菌肽。與已報(bào)道的純化手段相比[10]，該方法簡(jiǎn)便、成本較低、產(chǎn)物損失減少。其中，純化之前的熱處理步驟可以使大量與本研究無(wú)關(guān)的雜蛋白變性除去，使其后續(xù)的層析步驟變得簡(jiǎn)化。而本實(shí)驗(yàn)分離的抗真菌肽是熱穩(wěn)定多肽，并不會(huì)受到影響。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)顯示抗真菌肽的分子質(zhì)量為3.909kD。

真菌生長(zhǎng)抑制活性實(shí)驗(yàn)顯示，苦蕎種子抗真菌肽對(duì)于3種常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)致病真菌——綠色木霉、鏈格孢霉和白腐菌均有強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與目前報(bào)道的其他來(lái)源的抗真菌肽作用于不同真菌的結(jié)果十分吻合[14-15]，從而進(jìn)一步證明苦蕎抗真菌肽的真菌生長(zhǎng)抑制作用。

[1] 徐同, 柳良好. 木霉幾丁質(zhì)酶及其對(duì)植物病原真菌的拮抗作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2002, 32(2): 97-102.

[2] GUO Yongxia, WANG Hexiang, NG T B. Isolation of trichogin, an antifungal protein from fresh fruiting bodies of the edible mushroom Tricholoma giganteum[J]. Peptides, 2005, 26(4): 575-580.

[3] NG T B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and nonleguminous origins[J]. Peptides, 2004, 25: 1215-1222.

[4] 徐興軍, 陳麗, 呂建偉, 等. 中國(guó)林蛙和中華蟾蜍皮膚抗菌肽的分離純化及其抗菌活性[J]. 四川動(dòng)物, 2009, 28(2): 164-167.

[5] LAM S S L, WANG Hexiang, NG T B. Purification and characterization of novel ribosome inactivating proteins, alpha- and beta-pisavins, from seeds of the garden pea Pisum sativum[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 253: 135-142.

[6] LIN Peng, XIA Lixin, NG T B. First isolation of an antifungal lipid transfer peptide from seeds of a Brassica species[J]. Peptides, 2007, 28:1514-1519.

[7] WONG J H, NG T B. Vulgarinin, a broad-spectrum antifungal peptide from haricot beans (Phaseolus vulgaris)[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2005, 37: 1626-1632.

[8] LIN Peng, WONG J H, XIA Lixin, et al. Campesin, a thermostable antifungal peptide with highly potent antipathogenic activities[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 108: 259-265.

[9] 張昕, 崔曉東, 李玉英, 等. 苦蕎過(guò)敏蛋白全長(zhǎng)基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(1): 203-206.

[10] LEUNG H W, NG T B. A relatively stable antifungal peptide from buckwheat seeds with antiproliferative activity toward cancer cells[J].Journal of Peptide Science, 2007, 13: 762-767.

[11] SCHAGGER H, von JAGOW G. Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 166(2): 368-379.

[12] YUAN Moucun, CARMICHAEL W W. Carmichael detection and analysis of the cyanobacterial peptide hepatotoxins microcystin and nodularin using SELDI-TOF mass spectrometry[J]. Toxicon, 2004, 44(5): 561-570.

[13] SCHLUMBAUM A, MAUCH F, VGELI U, et al. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth[J]. Nature, 1986, 324: 365-367.

[14] 劉穎, 徐慶. 抗真菌肽LP-1的分離純化及特性分析[J]. 微生物學(xué)報(bào),1999, 39(5): 441-447.

[15] 代富英, 周金燕, 譚紅. 捷安肽素抗真菌作用機(jī)理研究[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 1(2): 86-90.

Purification and Activity of an Antifungal Peptide from the Seeds of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

BAI Cheng-zhi，WANG Zhuan-hua*，LI Yu-ying
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology,Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Q516；R392

A

1002-6630(2010)15-0004-04

2009-11-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30870525；30671084)；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007011077)

白承之(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：200723002001@mail.sxu.cn

*通信作者：王轉(zhuǎn)花(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)化學(xué)與工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn