韓 楓

（河南省商丘市第一人民醫(yī)院骨科，河南商丘 476100）

骨轉移瘤已經成為成年人中發(fā)病率最高的骨惡性腫瘤[1]，骨轉移瘤原發(fā)疾病多為乳腺癌、前列腺癌及肺癌等，隨病情進展常會引起病理性骨折、頑固性疼痛、高鈣血癥及神經壓迫等并發(fā)癥，嚴重降低了患者的生活質量。本文探討降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）在骨轉移瘤中的表達情況，并探討其相關性及表達意義，期望能為臨床應用降鈣素（calcitonin，CT）治療骨轉移瘤提供理論基礎和依據，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月～2010年12月在我科確診后行手術切除的骨轉移瘤標本18例，同時搜集完整資料（包括患者的基本情況、實驗室檢查、影像學資料和病理診斷）。18例患者，其中，男性8例，女性10例；年齡35～73歲，平均57歲。腫瘤轉移部位，脊柱11例（頸椎1例，胸椎5例，腰椎4例，骶椎1例），骨盆4例，股骨近端2例，股骨遠端1例。根據X線表現(xiàn)將18例標本分為兩組：成骨表現(xiàn)組4例，溶骨表現(xiàn)組14例。所有患者術后經病理確診均為骨轉移瘤，其中，12例發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶（肺癌4例，乳腺癌3例，腎癌2例，甲狀腺癌1例，前列腺癌1例，胃癌1例），6例經全身檢查未發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶。同時選取我科在脊柱手術中切除的多余的正常棘突10例，設為對照組，其中，男性6例，女性4例；年齡35～65歲，平均50歲。取棘突部位：頸椎3例，胸椎3例，腰椎4例。

1.2 實驗儀器及試劑

電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療儀器廠），超低溫冰箱（青島海爾集團公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），GT16-3A離心機（北京時代北利離心機有限公司），切片機（德國Leitz公司），降鈣素受體鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，S-P免疫組化染色試劑盒（北京中山金橋生物技術有限公司），PBS緩沖液，抗原修復液。

1.3 方法

1.3.1 取材包埋 切除的標本均置于10%福爾馬林溶液中固定15～20 h，然后放入5%硝酸銀溶液中脫鈣 48～72 h，此時用普通注射器針頭即可刺透骨質，然后在自來水下連續(xù)沖洗72 h。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，65℃浸蠟，制成蠟塊后放入-4℃冰箱中。

1.3.2 連續(xù)切片 切片機以4 μm厚度對蠟塊連續(xù)切片，貼于載玻片上，撈片后置60℃烤箱30～60 min，烤干備用。

1.3.3 HE染色 常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精脫水，蘇木素染色，水洗，分化，反藍，伊紅染色，脫水，二甲苯透明后封片。

1.3.4 免疫組織化學操作 按免疫組織化學常規(guī)SP染色方法與免疫組織化學試劑盒說明操作。

1.3.5 對照組設定 PBS液代替一抗為陰性對照。以10例已知CTR陽性表達的正常骨組織作為陽性對照組。

1.3.6 結果判定標準及方法 所取標本免疫組織化學染色結果的判斷參照許良中等[2]提出的等級評分方法為標準，切片中細胞核和胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，無棕黃色顆粒者為陰性。

1.3.7 統(tǒng)計學分析 采用陽性率作為統(tǒng)計數據，應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，所得結果用χ2檢驗或精確概率法進行檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

免疫組織化學染色結果顯示CTR表達于正常骨組織和骨轉移瘤細胞漿中。CTR在正常骨組織中表達的陽性率為30.0%，在骨轉移瘤中表達的陽性率為83.0%，二者有顯著性差異（表1）。CTR在骨轉移瘤分組中的表達：溶骨組的陽性率為92.8%，成骨組的陽性率為50.0%，二者有顯著性差異（表2）。

表1 降鈣素受體在正常骨組織和骨轉移瘤中的表達（例）Tab.1 The expression of CTR in normal bone tissue and bone metastases(case)

表2 降鈣素受體在成骨組和溶骨組中的表達（例）Tab.2 The expression of CTR in osteogenic group and osteolytic group （case）

3 討論

CT是一種包含有32個氨基酸的多肽類激素，在體內主要由甲狀腺C細胞合成、分泌，其在體內存在于多種組織中。CT的生理作用廣泛，可以調控受精卵著床與胚胎發(fā)育，還可以促進腎臟對 Ca2+的排泄，抑制破骨細胞（osteoclast，OC）的溶骨作用，維持Ca2+的平衡。自1962年Copp等[3]首次報道CT后，人們發(fā)現(xiàn)到CT對骨吸收有明顯的抑制作用，并由此推測骨組織中可能存在CTR。1980年Warshasky等[4]利用電鏡放射自顯影的方法首次報道OC表面存在CTR。1986年Nicholson等[5]在體外培養(yǎng)OC時，采用放射配基結合分析證實了在OC及前體細胞上存在大量的CT特異性結合位點。1991年Lin等[6]首次成功克隆出豬的CTR cDNA，它翻譯的蛋白包括482個氨基酸，分子量為55 kD。人與豬CTR結構相似，包含490個氨基酸，分子量8～9 kD，擁有7個跨膜結構及連接跨膜結構的4個胞外功能區(qū)（e1～4）和4個胞內功能區(qū)（i1～4），目前已證明N-端的e2功能區(qū)是CT的結合位點。種種研究證實了OC和前體細胞表面存在大量的CTR，CT和CTR結合后，能抑制OC的骨吸收作用，促進成骨，增加骨量。CTR是包含490個氨基酸并擁有7個跨膜結構G蛋白耦聯(lián)受體。

近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CTR在體內多種組織中廣泛存在。1980年Martin等[7]在克隆的人乳腺癌細胞系（MCF-7）中發(fā)現(xiàn)CTR表達。1987年Silvestronil等[8]在人精原細胞上發(fā)現(xiàn)CTR表達。1997年Gellisple等[9]在原發(fā)性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CTR表達，同時還發(fā)現(xiàn)這些表達CTR的癌組織表達骨橋蛋白。2005年張艷萍等免疫組化檢測不同發(fā)育階段小鼠胚胎和植入期子宮內膜，發(fā)現(xiàn)CTR在小鼠胚胎和植入期子宮內膜都有表達。2008年張豪偉等[10]發(fā)現(xiàn)骨巨細胞瘤和骨軟骨瘤中也有CTR表達。以上研究表明CTR可以在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中表達，而在乳腺、前列腺、肺等正常組織中則無表達，說明CTR可能與CTR陽性的惡性腫瘤骨轉移有關。目前已證明CTR在骨組織主要存在于OC膜上，CT和OC膜上的CTR結合后，通過一系列的信號轉導機制，抑制OC的骨吸收作用。目前對于CT和CTR結合后在OC中的信號轉導機制已明確：一種信號轉導途徑以Ca2＋為第二信使，CT和CTR結合后激活Gp，Gp再激活磷脂酶C(PLC)，激活狀態(tài)的PLC將細胞膜中的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解為 IP3和二?；视停―G），IP3和胞膜內的IP3受體結合，促進胞內Ca2＋的釋放，提高胞內Ca2＋水平，DG可以激活胞膜上的蛋白激酶C(PLC)，相關的蛋白發(fā)生磷酸化，增加Ca2＋的通透性，使胞內Ca2＋濃度升高，產生相應的生物學效應；另一種是以cAMP為第二信使的信號轉導途徑，其轉導機制為：CT和CTR結合后激活霍亂敏感蛋白（Gs），進而激活腺苷酸環(huán)化酶，在Mg2＋存在的條件下催化ATP生成cAMP，以cAMP為第二信使激活蛋白激酶A，啟動級聯(lián)反應，產生最終生物學效應。CT和CTR結合后在腫瘤細胞中的轉導機制尚不清楚，需進一步研究。本研究通過對18例骨轉移瘤標本免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)：CTR陽性表達15例，CTR陰性表達3例，CTR陽性率為83.0%；而對照組10例正常骨組織中，CTR陽性表達3例，CTR陰性表達7例，CTR陽性率為30.0%，經Fisher精確概率檢驗發(fā)現(xiàn)二者陽性率有顯著性差異。本研究中發(fā)現(xiàn)CTR在骨轉移瘤中高度表達，而在正常骨組織中低表達，說明骨轉移瘤的形成可能與其細胞表面的CTR有關，CTR在骨轉移瘤中高表達，可能是骨轉移瘤的一種新標志物。正常骨組織中CTR存在于OC上，骨轉移瘤中CTR可能存在于腫瘤細胞上，對骨轉移瘤中CTR進行檢測，將有助于骨轉移瘤的早期診斷和預后評估。骨轉移瘤的轉移途徑主要為血液循環(huán)途徑，少數經淋巴循環(huán)系統(tǒng)，由于多數惡性腫瘤細胞表面表達CTR，為下一步應用CT治療惡性腫瘤提供了可能，但是CT和腫瘤細胞表面CTR的結合機制以及結合后的生物學效應尚不清楚。

骨腫瘤根據X線表現(xiàn)可以分為成骨型、溶骨型和混合型。骨轉移瘤在X線表現(xiàn)上成骨型和混合型少見，多為溶骨型表現(xiàn)。前列腺癌、肺癌、胃癌和近半數的乳腺癌的骨轉移瘤X線表現(xiàn)為成骨型，而腎癌、甲狀腺癌、肺癌、結腸癌的X線表現(xiàn)多為溶骨性破壞。目前認為骨轉移瘤的溶骨作用與OC的骨吸收有關，OC的溶骨活性可被腫瘤細胞釋放的調節(jié)因子增強，從而加速骨的分解代謝，同時還可以抑制轉移灶的成骨作用，最終產生溶骨性病灶。其中較為重要的調節(jié)因子有甲狀腺素相關蛋白[11]與細胞核因子κB受體活化因子配基（RNAKL）。有文獻報道RNAKL在多種腫瘤細胞中大量表達，能導致OC活化和大量骨質溶解破壞[12]。而某些骨轉移瘤表現(xiàn)為成骨性改變，這可能是由于轉移灶釋放的成骨因子促進成骨細胞的增殖和分化所致。研究發(fā)現(xiàn)由前列腺癌細胞產生的TGF-β是一種活性較強的成骨因子，能提高前列腺癌骨轉移灶中成骨細胞的活性，因此前列腺癌骨轉移中成骨型比較常見。同時前列腺癌細胞還能分泌成纖維細胞生長因子（FGF），它能刺激成骨細胞的增殖和成骨活性。CTR在溶骨型骨轉移瘤中高表達，CTR可能與上述細胞因子相互作用共同調節(jié)骨轉移瘤的溶骨性或成骨性破壞有關。本研究18例患者，根據X線表現(xiàn)分為兩組：成骨表現(xiàn)組4例，CTR 陽性表達 2例（50.0%）；溶骨表現(xiàn)組 14例，CTR 陽性表達13例（92.8%），經Fisher精確概率檢驗發(fā)現(xiàn)二者陽性率有顯著性差異。研究結果表明溶骨型骨轉移瘤中CTR表達水平高于成骨型，CTR的表達水平與轉移瘤的溶骨性破壞有關。CTR高表達的骨轉移瘤溶骨破壞比較明顯，而CTR低表達的骨轉移瘤成骨作用比較明顯。當然，在骨轉移瘤溶骨和成骨過程中還有其他細胞因子的參與，同時與原發(fā)腫瘤的性質有關。因此，CTR并不是調節(jié)骨轉移瘤溶骨的唯一因素，可能有其他因素相互作用共同調節(jié)骨轉移瘤的溶骨作用。

本研究證實了CTR在骨轉移瘤中的表達水平高于正常骨組織，而且在溶骨型骨轉移瘤中的表達水平高于成骨型骨轉移瘤，為臨床進一步應用CT診斷、治療骨轉移瘤溶骨性破壞提供了相關的理論基礎及思路。

[1]Unni KK.Dahlin′s bone tumors∶general aspects and data on 11087 cases[M].5th ed.Philadelphia∶Lippincott-Raven,1996∶369-375.

[2]許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志,1996,6(4)∶229-231.

[3]Copp A,Sexon PM,Pondel M.Calcitonin and its physiological role in human[J].Science,1962,81(6)∶405-419.

[4]Warshasky H,Golizman D,Rouleau MF,et al.Direct in vivo demonstration by radioautography of specific binding sites for calcitonin in skeletal and renal tissue of the rat[J].J Cell Biol,1980,85(3)∶682-694.

[5]Nicholson GC,Mosciey JM,Sexton PM,et al.Abundant calcitonin receptor in isolated rat osteoclasts∶biochemical and autoradiographic characterization[J].Clin Invest,1986,78∶355.

[6]Lin HY,Harris TL,Flanery MS,et al.Expression cloning and characterization of a porcine renal calcitonin receptor[J].Science,1991,254∶1022-1024.

[7]Martin TJ,Findlay DM,Maclntyre L,et al.Calcitonin receptors in a cloned human breast cancer line (MCF-7)[J].Biochem Biophys Res Commun,1980,96(1)∶150-156.

[8]Silvestroni L,Menditto A,Frajese G,et al.Identification of calcitonin receptors in human spermatozoa[J].Clin Endocrin Metab,1987,65(4)∶742-746.

[9]Gellisple MT,Thomas RJ,Pu ZY,et al.Calcitonin receptors bone sialoprotein and osteopontin are expressed in primary breast cancer[J].Int J Cancer,1997,73∶812-815.

[10]張豪偉,王衛(wèi)東,趙亮,等.降鈣素受體在骨巨細胞瘤中的表達及與Jaffe分級的關系[J].中國實用醫(yī)刊,2008,35(11)∶7-8.

[11]Powell GJ,Southby J,Danks JA,et al.Localization of parathyroid hormone-related protein in breast cancer metastasis∶Increased incidence in bone compared with other sites[J].Cancer Res,1991,51∶3059-3061.

[12]Zawa S,Kitazawa R.RANK ligand is a prerequisite for cancer-associated osteolytic lesions[J].Pathol,2002,198∶228-236.