夏 曦，劉 玲

（廣東省佛山市順德龍江醫(yī)院，廣東順德 528318）

舒筋通絡(luò)外用顆粒為順德龍江醫(yī)院制劑，由當(dāng)歸、大黃、獨(dú)活、桂枝等十三味中藥組成。采用部分藥材粉碎成細(xì)粉，其余藥材水煮醇沉制成稠浸膏后與細(xì)粉混合干燥而成的一種外用顆粒劑。使用時(shí)加水外洗、外敷均可，具有溫經(jīng)通絡(luò)，祛瘀止痛的作用，用于跌打損傷，筋骨疼痛，關(guān)節(jié)不利。本文建立了當(dāng)歸、大黃、獨(dú)活、桂枝的薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)其主要成分大黃素（C15H10O5）和大黃酚（C15H10O4）進(jìn)行含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent化學(xué)工作站（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；METTLER AE240電子分析天平；CQ-20超聲波清洗器。

1.2 試藥

大黃素、大黃酚對(duì)照品及當(dāng)歸、獨(dú)活、桂枝、大黃對(duì)照藥材，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；舒筋通絡(luò)外用顆粒，由廣東省順德龍江醫(yī)院制劑室提供；甲醇光譜純（天津四友化工廠）；薄層層析硅膠G（化學(xué)純，中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活薄層鑒別

因大黃的5個(gè)蒽醌類成分對(duì)當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的薄層色譜鑒別有干擾，故先用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液將其分離出去；曾用石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（4∶1）為展開劑進(jìn)行薄層層析，但當(dāng)歸的色譜斑點(diǎn)與桂枝的色譜斑點(diǎn)分離度欠佳，當(dāng)選用大黃的薄層色譜展開劑系統(tǒng)時(shí)，當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的色譜成分均能達(dá)到有效分離。

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品3 g，研細(xì)，加乙醚40 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液置分液漏斗中，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20 ml，合并洗液，備用。乙醚液再用水10 ml，洗滌1次，揮干乙醚，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.8 g，桂枝對(duì)照藥材0.2 g，獨(dú)活對(duì)照藥材0.5 g，分別加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制法，分別制成缺當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的陰性樣品，各取3 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.1.4 薄層層析 照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述七種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識(shí)。供試品色譜中，在與當(dāng)歸對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的亮藍(lán)白色熒光斑點(diǎn)；在與桂枝對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)；在與獨(dú)活對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜在相應(yīng)位置上無干擾，可作為當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖1。

2.1.2 大黃薄層鑒別

大黃中含有多種蒽醌類成分，具有抗菌、抗感染等作用?？紤]大黃素和大黃酚在其他藥材中存在，故在含量測(cè)定項(xiàng)測(cè)定大黃素和大黃酚之前，還要進(jìn)行大黃的薄層色譜鑒別，用大黃對(duì)照藥材作為對(duì)照，與其他含有大黃素和大黃酚的藥材進(jìn)行區(qū)別。

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取“2.1.1.1”項(xiàng)下的洗液用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 ml，合并提取液，揮干，殘?jiān)訜o水乙醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 大黃對(duì)照藥材溶液的制備 取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.2.3 大黃陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制法，制成不含大黃的陰性樣品，取3 g，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制成大黃陰性對(duì)照溶液。

2.1.2.4 薄層層析 照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識(shí)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個(gè)橙黃色熒光主斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜在相應(yīng)位置上無干擾，可作為大黃的薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖2。

因當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的色譜成分對(duì)大黃的薄層色譜鑒別有干擾，故先將大黃的蒽醌類成分用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液分離出來，酸化后再用乙醚進(jìn)行提取。

2.2 含量測(cè)定

本品處方由13味中藥組成，其中以大黃為主藥，大黃素和大黃酚是其主要有效成分，故選作含量測(cè)定指標(biāo)。正文參照《中國(guó)藥典》2005年版及2000年版一部“大黃”項(xiàng)下收載的含量測(cè)定方法，采用HPLC法測(cè)定兩者的總量，試驗(yàn)結(jié)果如下：

2.2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特Hypersil ODS-2（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 ml/min。 柱溫：30℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并置入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備

取按處方比例及制法制備的缺大黃陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，即得。

2.2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別取大黃素和大黃酚對(duì)照品溶液，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果大黃素在 221、254、265、290、437 nm，大黃酚在 204、225、256、278、287、429 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，兩者均在（254±2）nm波長(zhǎng)處有最大吸收，為了同時(shí)測(cè)定大黃素和大黃酚的含量，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm，與《中國(guó)藥典》2000年版及2005年版一部“大黃”含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定波長(zhǎng)相同。

2.2.6 系統(tǒng)適用性

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖3。結(jié)果表明陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定沒有干擾。

2.2.7 線性關(guān)系考察

2.2.7.1 大黃素 分別精密吸取每毫升含大黃素1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg 的大黃素對(duì)照品溶液 10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，測(cè)得峰面積分別為 37.25、73.35、185.51、372.17、744.59、1 868.63。 以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明，大黃素在0.010 0～0.500 0 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=3 738.66X-1.420 8（r=0.999 9）。

2.2.7.2 大黃酚 分別精密吸取每毫升含大黃酚2.50、5.00、12.50、25.00、50.00、125.00 μg 的大黃酚對(duì)照品溶液 10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，測(cè)得峰面積分別為 129.37、259.09、649.07、1 325.46、2 636.84、6 388.43。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明，大黃素在0.025 0～1.250 0 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為Y=511 1.80X-23.717 7（r=0.999 9）。

2.2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取大黃素（10.00 μg/ml）、大黃酚（25.00 μg/ml）混合對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果表明本法精密度良好。見表1。

表1 精密度試驗(yàn)（n=6）Tab.1 Precision test(n=6)

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：050701），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）Tab.2 Repeatability test(n=6)

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于放置 0、1、2、3、4、24 h后，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=6）Tab.3 Stability test(n=6)

2.2.11 加樣回收試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)：050701，測(cè)得大黃素含量為0.6654mg/g、大黃酚為1.640 3 mg/g）6份，各0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液（含大黃素 50.00 μg/ml、大黃酚 125.00 μg/ml）各5 ml，混勻，水浴揮干，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見表4、5。

2.2.12 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中大黃素和大黃酚的含量，結(jié)果見表6。

3 討論

本品為外用顆粒劑，使用時(shí)只要加溫水溶化即可。經(jīng)文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)類似的制劑，為本院制劑室獨(dú)有，具有劑量小，攜帶方便等諸多優(yōu)點(diǎn)。在本院臨床以來，具有療效確切、起效快、療程短、未見毒副反應(yīng)發(fā)生，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)總有效率為95%以上，這為中藥外用制劑的開發(fā)提供了一個(gè)新的途徑。

表4 大黃素加樣回收試驗(yàn)（n=6）Tab.4 Recovery test of Emodin(n=6)

表5 大黃酚加樣回收試驗(yàn)（n=6）Tab.5 Recovery test of Chrysophanol(n=6)

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.6 Content determination results of samples(%,n=3)

由于處方中成分較復(fù)雜，干擾了薄層色譜的檢識(shí)，作者充分利用處方中欲測(cè)成分不同化學(xué)性質(zhì)，采用各種前處理方法，有效地排除了干擾，保留了欲測(cè)成分，對(duì)處方中主要組成藥物當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活、大黃進(jìn)行了薄層分析，薄層色譜顯示清晰，空白無干擾。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中大黃素和大黃酚的含量，重現(xiàn)性好，精密度高，易于操作，能夠有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。成品要求含大黃素不得低于8 mg/15 g和大黃酚不得低于20 mg/15 g。本法可作為測(cè)定中藥復(fù)方制劑中大黃素和大黃酚含量的參考。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:17.

[2]陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京:中醫(yī)古藉出版社,1994:66.

[3]黎俊華.復(fù)方止血顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房,2006,17(8):614.

[4]郭丹,陳娜娜.高效液相色譜法測(cè)定常通口服液中大黃素的含量[J].中國(guó)藥房,2003,14(5):206.

[5]廖華衛(wèi),李瑞珍.大黃中大黃酚的提取分離和純化方法研究[J].中國(guó)藥房,2006,17(12):956.

[6]張曉東.高效液相色譜法測(cè)定舒筋片中大黃素、大黃酚的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,4(18):78-80.

[7]張斯時(shí).大黃素藥理作用的研究概況[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,3(23):68-69.

[8]蔣云根,白玫.高效液相色譜法測(cè)定喜食片中大黃素、大黃酚的含量[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(15):109-110.