藍江林，劉波，朱育菁，林營志，葛慈斌，劉蕓

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州350003

水葫蘆內(nèi)生細菌脂肪酸生物標記特性研究

藍江林，劉波*，朱育菁，林營志，葛慈斌，劉蕓

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州350003

應(yīng)用基于微生物細胞脂肪酸成分鑒定的全自動微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定水葫蘆內(nèi)生細菌25株，分屬15個屬.共檢測到27個脂肪酸生物標記（PLFAs），這些生物標記分為4種類型，即（1）高頻次分布：在25株細菌中出現(xiàn)13～22次，屬于細菌總體類群（general）的生物標記.（2）中頻次分布：在25株細菌中出現(xiàn)5～7次，可以用于代表細菌屬類群（genus）識別生物標記.（3）低頻次分布：在細菌中的分布概率較小，可以用于指示特定細菌種間差異的生物標記.（4）微頻次分布：僅在一種細菌種類出現(xiàn)，是細菌種（species）特征生物標記.利用脂肪酸生物標記分析同屬細菌不同種的差異，可將微桿菌屬分為2類，第1類包括菌株9Microbacterium barkeri和11Microbacterium imperiale，這兩個菌株 17:0 ISO 和 14：0 ISO 的脂肪酸生物標記含量均為 0.第2類包括 10Microbacterium esteraromaticum、12Microbacterium lacticum和13Microbacterium liquefaciens，這3個菌株均含有17：0 ISO脂肪酸生物標記而區(qū)別于第一類菌株.利用脂肪酸生物標記的差異對25株內(nèi)生細菌進行聚類分析，可將水葫蘆內(nèi)生細菌類群分為4類.不同植物內(nèi)生菌群落中存在著特異的生物標記，利用特征脂肪酸生物標記的分析方法，分析水葫蘆內(nèi)生細菌的群體特性，對于植物內(nèi)生菌微生物群落的研究具有重要意義.

內(nèi)生細菌；脂肪酸生物標記；聚類分析

Received 23 May 2009 accepted 15 July 2009

Abstract：The present paper dealt with isolation and identification of the endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms.as well as characteristics of their PLFA biomarkers.Results showed that 25 species of endophyte bacteria were identified by means of microbe identification system（MIDI system from USA）.There were 27 PLFA biomarkers detected in 25 species of endophyte bacteria,in which based on the distribution frequency in the bacteria 4 types were clustered e.g.（1）high frequency related to characteristics of microbe in general,（2）middle frequency related to bacteria in general,（3）low frequency related bacterial genus,（4）tiny frequency related to species.According to PLFAs biomarkers, 5speciesofgenusMicrobacterium weredivided into 2 groups,thegroups1 included Microbacterium barkeriand Microbacterium imperiale,there were no biomarker of 17：0 ISO and 14：0 ISO.The groups 2 included Microbacterium esteraromaticum,Microbacterium lacticum and Microbacterium liquefaciens with 17：0 ISO biomarker higher than 1.85%. Using the cluster analysis method the 25 species were classified into 4 groups based on the PLFAs biomarkers.The characteristics of the groups were discussed.There were the specific biomarker represented the endiophyte bacterica which also isolated from other plants.The research provided the analysis pattern to treat the PLFA biomarkers and analyse group characteristics of endophyte bacteria to clear the community structure of endophyte bacteria in Eichhornia crassipe（Mart.）Solms.

Keywords：endophyte bacteria；PLFAs biomarkers；cluster analysis

1 引言（Introduction）

水葫蘆（Eichhornia crassipe（Mart.）Solms）又名鳳眼蓮，屬單子葉多年生植物，雨久花科，鳳眼蘭屬，可進行有性和無性繁殖，在南方大部分地區(qū)可周年發(fā)生，是世界上繁殖最快的水草之一（段惠等，2003）.目前，已在南方諸多水域泛濫成災(zāi)，國內(nèi)外許多科研工作者正嘗試各種方法進行防除，但都難以達到徹底根除的效果.

植物內(nèi)生細菌（Endophyte bacteria）是指能在健康植物組織內(nèi)棲居而對植物不造成實質(zhì)性危害而與植物建立了和諧聯(lián)合（Compatible association）關(guān)系的微生物（Di Fiore and Del Gallo,1995）.在宿主的影響下，內(nèi)生菌的不同亞群會在不同的環(huán)境中形成，當宿主植物在環(huán)境惡化的情況下，它會選擇那些增強其抵抗惡劣環(huán)境的內(nèi)生菌亞群的侵染（Siciliano et al.,2001）.內(nèi)生細菌對宿主的選擇存在一定的專一性，因此，特定的宿主其內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)具有相應(yīng)的特異性.據(jù)不完全資料統(tǒng)計，已從近 30種植物分離到近 60個屬的內(nèi)生細菌（Kobayashi and Palumbo,2000），涉及的植物主要有小麥（王剛和李志強，2005）、水稻（沈德龍等，2000）、棉花（羅明等，2004）、花生（宋子紅等，1999）、馬鈴薯（沈麗珍等，2008）、番茄（李艷琴等，2003）、黃瓜（王振躍等，2008）、辣椒（黎起秦等，2004）、甜瓜（周婧等，2008）、香蕉（付業(yè)勤等，2007）、煙草（彭細橋等，2007）等，研究的重點在于內(nèi)生細菌作為生防因子的開發(fā).水葫蘆作為一種外來入侵物種，在不斷適應(yīng)外部環(huán)境的過程中，其內(nèi)部微生態(tài)環(huán)境也形成了獨特的結(jié)構(gòu)，從而促進了水葫蘆和生存環(huán)境的系統(tǒng)平衡，但到目前，水葫蘆內(nèi)生細菌的研究尚未見報道.

本研究引入脂肪酸生物標記分析方法，對水葫蘆內(nèi)生細菌進行研究.脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，是生物體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，作為細胞表面物質(zhì)與細胞識別、種族特異性和細胞免疫等有密切關(guān)系.細菌的細胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細菌的DNA具有高度的同源性，各種細菌均具有其特征性的細胞脂肪酸指紋圖譜（Chen et al.,2008）.脂肪酸生物標記（PLFAs）能夠靈敏地反應(yīng)微生物群落產(chǎn)生的變化（劉波等，2009）.

為了利用微生物脂肪酸生物標記分析水葫蘆內(nèi)生細菌的種群組成，本研究從水葫蘆植株中分離內(nèi)生細菌，利用全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行種類鑒定，分析研究內(nèi)生細菌的脂肪酸生物標記的特性，為水葫蘆內(nèi)生細菌群落動態(tài)研究提供基礎(chǔ)，從而為水葫蘆的利用和防除提供新的思路.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 試驗材料

菌株：從水葫蘆植株分離純化的內(nèi)生細菌25株.氣相色譜系統(tǒng)：美國Agilent 6890N型.包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器.分析軟件：美國MIDI公司開發(fā)的基于微生物細胞脂肪酸成分鑒定的全自動微生物鑒定系統(tǒng)Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System）和LGS4.5（Library Generation Software）.

2.2 試驗方法

2.2.1 內(nèi)生細菌的鑒定

a.脂肪酸的提取和氣相色譜檢測

脂肪酸的提取和氣相色譜檢測參考王秋紅等（2007）.細菌培養(yǎng)采用TSBA培養(yǎng)基：30g胰蛋白胨大豆肉湯（TSB，購于Fisher公司）+15g瓊脂+1L水.脂肪酸提取試劑：（1）皂化試劑：45g氫氧化鈉+150mL甲醇+150mL水；（2） 甲基化試劑：325mL 6mol·L-1鹽酸+275mL甲醇；（3）萃取試劑：200mL正已烷+200mL甲基叔丁基乙醚；（4）洗滌試劑：10.8g氫氧化鈉+900mL水.配制方法由MIDI公司提供.

脂肪酸提取：（1）獲菌：用接種環(huán)挑取3～5環(huán)（約40mg濕重）的菌落置入一個干凈、干燥的有螺旋蓋的試管中（最佳的獲菌區(qū)域為第3區(qū)）；（2）皂化：加入（1.0±0.1）mL皂化試劑，擰緊蓋子，振蕩5～10s，放入95～100℃的沸水中5min，室溫冷卻，振蕩5～10s，再水浴25min，室溫冷卻；（3）甲基化：開蓋加入（2.0±0.1）mL甲基化試劑，擰緊蓋子，振蕩5～10s，（80±1）℃水浴10min，移開且快速用流動自來水冷卻至室溫；4）萃取：加入（1.25±0.1）mL的萃取試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)10min，打開管蓋，利用干凈的移液管取出每個樣本的下層水相部份；（5）基本洗滌：加入（3.0±0.2）mL洗滌試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)5min，打開管蓋，利用干凈的移液管移出約2/3體積的上層有機相到干凈的氣相色譜檢體小瓶，用于氣相檢測.

氣相色譜檢測：在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，5℃·min-1升至260℃，而后40℃·min-1升溫至310℃，維持90s；汽化室溫度250℃、檢測器溫度300℃；載氣為氫氣（2mL·min-1）、尾吹氣為氮氣（30mL·min-1）；柱前壓10.00psi（1psi= 6.895kPa）；進樣量1μL，進樣分流比100：1.b.細菌種類鑒定（脂肪酸鑒定法）

系統(tǒng)根據(jù)各組分保留時間計算等鏈長（ECL）值確定目標組分的存在，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，再將二者與系統(tǒng)譜庫中的標準菌株數(shù)值匹配計算相似度（Similarity Index, SI），從而給出一種或幾種可能的菌種鑒定結(jié)果.一般以最高SI的菌種名稱作為鑒定結(jié)果，但當其報告的幾個菌種的SI比較接近時，則根據(jù)色譜圖特征及菌落生長特性進行綜合判斷.以脂肪酸混合標樣校正保留時間（Moore-Kucera and Dick, 2007）.

2.2.2 水葫蘆內(nèi)生細菌脂肪酸生物標記特性分析

將鑒定出的內(nèi)生細菌脂肪酸生物標記含量百分比列表分析，比較生物標記在各細菌中分布特性，包括高頻次分布生物標記、中頻次分布生物標記、低頻次分布生物標記、微頻次分布生物標記、特異性分布生物標記、無特異性生物標記的細菌等.以微桿菌為例，分析水葫蘆內(nèi)生細菌同屬細菌脂肪酸生物標記的差異.以脂肪酸生物標記為指標，以菌種為樣本，構(gòu)建矩陣，將矩陣數(shù)據(jù)進行中心化處理，以歐氏距離為聚類尺度，用最小距離法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析（王秋紅等，2007）.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 水葫蘆內(nèi)生細菌的鑒定

水葫蘆內(nèi)生細菌的鑒定結(jié)果見表1，水葫蘆主要內(nèi)生細菌包括了14屬的25種細菌，鑒定的相似性指數(shù)均大于0.5，為典型菌種.

表1 水葫蘆內(nèi)生細菌的鑒定Table 1 Identification of endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

3.2 水葫蘆內(nèi)生細菌脂肪酸生物標記的分布特性

水葫蘆內(nèi)生細菌脂肪酸生物標記的分布特性試驗結(jié)果見表2.水葫蘆內(nèi)生細菌測定到27個有效脂肪酸生物標記，這些生物標記分為4種類型：

（1）高頻次分布：脂肪酸生物標記在被測的25種細菌中出現(xiàn)概率很高，分布頻次在 0.4815～0.8148之間，即在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)13～22次，屬于這些生物標記的是16：0、15： 0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO、16：0 ISO，表明這些生物標記可以用于代表細菌總體類群.

（2）中頻次分布：脂肪酸生物標記在被測的25細菌中出現(xiàn)概率中等，分布頻次在0.1852～0.2593之間，即在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)5～7次，屬于這些生物標記的是17：0 ISO、14：0 ISO、18：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH、14：0，表明這些生物標記可以用于代表細菌屬類群，如 12：0 3OH生物標記，指示著假單胞菌屬.

表2 內(nèi)生細菌磷脂脂肪酸生物標記反應(yīng)值及各多樣性指數(shù)Table 2 Distribution characteristics of PLFA biomarkers in endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

（3）低頻次分布：脂肪酸生物標記在被測的25細菌種出現(xiàn)頻次較低，分布概率在0.0741～0.1481之間，即在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)2～4次，屬于這些生物標記的是12：0 2OH、10：0 3OH、18：1W9C、17：0CYCLO、TBSA10ME18：0、17：0、17：1 W8C、15：1 ANTEISO A、16：1 W11C，表明這些生物標記可以用于代表特定細菌種間差異，如15：1 ANTEISO A生物標記在Cellulomonas flavigena和Kocuria kristinae中有分布，其他種類沒有分布.

（4）微頻次分布：脂肪酸生物標記在被測的25種細菌中出現(xiàn)在一個細菌中，分布概率為0.0370，屬于這些生物標記的是 ISO 17：1 W10C、13：0 ANTEISO、16：0 10 METHYL、16：0 3OH、16：1 W7C ALCOHOL、17：0 10 METHYL，表明可以用于代表細菌特征性生物標記.

第1～3類生物標記共21個，序號1～21，屬于常規(guī)類型的生物標記，可用于微生物群落研究.第4類生物標記有6個，序號22～27，屬于特殊類型的生物標記，指示著微生物種的特殊性，不用于微生物群落研究.

3.3 水葫蘆內(nèi)生細菌特征性脂肪酸生物標記

將微頻次分布的6個生物標記作為水葫蘆內(nèi)生細菌特征性脂肪酸生物標記分析的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果見表3.表中列出的6個特殊類型脂肪酸生物標記為6種細菌的特異性生物標記.Arthrobacter ureafaciens特異性生物標記為 13：0 ANTEISO（1.86%，脂肪酸生物標記含量，下同）；Bacillus pumilus的特異性生物標記為 ISO 17：1 W10C（4.49%）；Bacillus sphaericus的特異性生物標記為16：1 W7C ALCOHOL（11.61%）；Nocardia nova的特異性生物標記為 16：0 10 METHYL（0.66%）；Rhizobium rubi的特異性生物標記為 16：0 3OH（4.13%）；Rhodococcus rhodnii的特異性生物標記為17：0 10 METHYL（4.23%）.

表3 水葫蘆細菌特征性脂肪酸生物標記Table 3 Special PLFA biomarkers for endophyte bacteria from Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

3.4 無特異性脂肪酸生物標記的水葫蘆內(nèi)生細菌

將微頻次分布的6個脂肪酸生物標記作為分析無特異性脂肪酸生物標記的水葫蘆內(nèi)生細菌的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果列表4.1Acinetobacter calcoaceticus、2Arthrobacter globiformis、 4Bacillus megaterium、7Cellulomonas flavigena、8Kocuria kristinae、9Microbacterium barkeri、10Microbacterium esteraromaticum、11Microbacterium imperiale、12Microbacterium lacticum、13Microbacterium liquefaciens、14Micrococcus luteus、15Nesterenkonia halobia、17Paenibacillus macerans、18Paucimonas lemoignei、19Pseudomonas fluorescens、20Pseudomonas putida、21Pseudomonas vancouverensis、23Rhodococcuserythropolis、25Xanthobacter flavus，這19個菌株均不含有特異性脂肪酸生物標記.

表4 無特異性脂肪酸生物標記的水葫蘆內(nèi)生細菌Table 4 Endophyte bacteria without special PLFA biomarkers

3.5 水葫蘆內(nèi)生細菌同屬細菌脂肪酸生物標記的差異

3.5.1 脂肪酸生物標記的差異分析

選擇5株微桿菌屬細菌，脂肪酸生物標記列于表5.以菌種為指標，以脂肪酸生物標記為樣本，構(gòu)建矩陣，以歐氏距離為聚類尺度，用最短距離法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果見圖1.當λ= 24.86時，可將微桿菌屬的脂肪酸生物標記分為3類，第1類包括了4個脂肪酸生物標記，即16：0、15：0 ISO、17：0 ISO和14：0 ISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種細菌中含量極低或為零.第2類包括了 2個脂肪酸生物標記，即 17：0 ANTEISO和16：0 ISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種細菌中含量較高，分布比例較均衡.第3類包括 1個脂肪酸生物標記，即 15：0 ANTEISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種的細菌中較高且分布均衡.

表5 微桿菌屬不同種的脂肪酸生物標記的差異Table 5 Variation of PLFA biomarkers in the species of Microbacterium genus

圖1 微桿菌屬不同種的脂肪酸生物標記聚類分析Fig.1 Cluster analysis of PLFA biomarkers in the species of Microbacterium genus

3.5.2 微桿菌屬細菌種的差異分析

圖2 微桿菌屬不同種的聚類分析Fig.2 Cluster analysis for Microbacterium genus tested

以脂肪酸生物標記為指標，以菌株為樣本，構(gòu)建矩陣，以歐氏距離為聚類尺度，用最短距離法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果見圖2.當λ= 11.24時，可將菌株分為2類.第一類包括菌株9Microbacterium barkeri和11Microbacterium imperiale，這兩個菌株17：0 ISO和14：0 ISO的脂肪酸生物標記含量均為 0.第二類包括 10Microbacterium esteraromaticum、12Microbacterium lacticum和13Microbacterium liquefaciens，這 3個菌株均含有17：0 ISO脂肪酸生物標記而區(qū)別于第一類菌株.

3.6 基于脂肪酸生物標記的水葫蘆內(nèi)生細菌聚類分析

將高頻次、中頻次、低頻次分布的25個細菌脂肪酸生物標記列表6.以脂肪酸生物標記為指標，以菌種為樣本，構(gòu)建矩陣，以歐氏距離為聚類尺度，用最短距離法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果見圖3.當λ=31.99時，可將25株水葫蘆內(nèi)生細菌分為4類：

第一類包括4個菌株，1Acinetobacter calcoaceticus（不動桿菌屬醋酸鈣種）、16Nocardia nova、23Rhodococcus erythropolis（紅串紅球菌）和24Rhodococcus rhodnii.這類細菌均含有特征脂肪酸生物標記18：1 W9C.

第二類包括 4個菌株分別是 18Paucimonas lemoignei、19Pseudomonas fluorescens（熒光假單胞菌）、20Pseudomonas putida（戀臭假單胞菌）、21Pseudomonas vancouverensis.菌株主要脂肪酸生物標記為16：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH和17：0 CYCLO.

第三類包括 2個菌株，22Rhizobium rubi和25Xanthobacter flavus（黃黃色桿菌），菌株特征脂肪酸生物標記為18：1 W7C.

第四類包括15個菌株，分別是2Arthrobacter globiformis（球狀節(jié)桿菌）、3Arthrobacter ureafacien（煙草節(jié)桿菌）、4Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌）、5Bacillus pumilus（短小芽孢桿菌）、6Bacillus sphaericus（球形芽孢桿菌）、7Cellulomonas flavigena（產(chǎn)黃纖維單胞菌）、8Kocuria kristinae（克氏庫克菌（克氏微球菌）、9Microbacterium barkeri、10Microbacterium esteraromaticum、11Microbacterium imperiale（微小桿菌）、12Microbacterium lacticum、13Microbacterium liquefaciens、14Micrococcusluteus（藤黃微球菌）、15Nesterenkonia halobia（鹽生內(nèi)斯特蘭克菌）、17Paenibacillus macerans（浸麻芽孢桿菌）.這類菌株主要的脂肪酸生物標記為16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO和16：0 ISO.

圖3 菌株系統(tǒng)聚類圖Fig.3 Cluster analysis for endophyte bacteria system

表6 細菌主要脂肪酸生物標記Table6Themainbacterium PLFA biomarkers

4 討論（Discussion）

有關(guān)植物內(nèi)生細菌的研究，已經(jīng)逐漸成為一個熱點，研究包括內(nèi)生細菌的分離、鑒定（Steenhoudt and Vanderleyden,2000;Sturz et al.,1997;Dong et al.,1994）；作為植物病害生物防治因子的開發(fā)，如假單胞菌屬（Pseudomonas）（Ravel et al.,1997;劉國奇和蔣如璋，1999;黎起秦等，2004），芽孢桿菌屬（Bacillus）（Ravel et al.,1997;馬艷等，2006;黎起秦等，2006;何紅等，2004）；作為人類疾病或保健藥品的新的來源等等（Castillo et al.,2002）.植物內(nèi)生細菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中天然組成成分，它們可能促進了寄主植物對環(huán)境的適應(yīng)，加強了系統(tǒng)的生態(tài)平衡（王萬能等，2005）.Lacava1等（2004）研究表明，在成熟的柑橘植株體內(nèi)，內(nèi)生菌代表的小生境變得更加穩(wěn)定和均衡，從而導(dǎo)致一種選擇壓力，這種選擇壓力更加適合刺激每個定殖微生物種群的基因型.因此，內(nèi)生細菌可能表現(xiàn)出一種調(diào)節(jié)自身到更穩(wěn)定環(huán)境的趨勢，結(jié)果導(dǎo)致彼此間更緊密的相互作用.本研究利用脂肪酸鑒定技術(shù)對水葫蘆25株內(nèi)生細菌進行鑒定，共有14個屬，分別是不動桿菌屬（Acinetobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、庫克菌屬（Kocuria）、微桿菌屬（Microbacterium）、微球菌屬（Micrococcus）、涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）、奴卡菌屬（Nocardia）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、Paucimonas、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、紅球菌屬（Rhodococcus）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）.其中微桿菌屬（Microbacterium）種類最多，有5個種；芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均有3個種.

分離鑒定的結(jié)果表明水葫蘆有比較豐富的內(nèi)生細菌.一部分內(nèi)生菌在其他植物已有研究報道，如芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為最常見屬（鄒文欣等譚仁祥，2001），含有許多作為生防因子開發(fā)的菌株（羅明等，2004;姚麗瑾等，2008;殷曉敏等，2008;石晶盈等，2007）；微桿菌（Microbacterium）（黎起秦等，2006）、不動桿菌（Acinetobacter）（付業(yè)勤等，2007;陳欣等，2006）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）和黃色桿菌（Xanthobacter）（祝明亮等，2004）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（饒小莉 等 ，2007）、根瘤菌屬（Rhizobium）（歐江，2007;曹月青和殷幼平，2001）等，也廣泛地分布在不同的植物內(nèi)，并有不少關(guān)于它們的生物學(xué)特性和功能研究的報道.另一部分內(nèi)生細菌，如纖維單胞菌屬（Cellulomonas）（Elberson et al.,2000;歐江，2007;曹月青和殷幼平，2001）、庫克菌屬（Kocuria）（Kim et al.,2004;陳華紅等，2004a）、微球菌屬（Micrococcus）（Reddy et al.,2000;潘利華等，2003）、涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）（Li et al.,2008;陳華紅等，2004b）、奴卡菌屬（Nocardia）（Kageyama et al.,2004;劉月廉等，2006）、Paucimonas（K?mpfer et al.,2007）、紅球菌屬（Rhodococcus）（Matsuyama et al.,2003），從水葫蘆植株分離出來，未見從其它植物體內(nèi)分離的報道.

利用脂肪酸分析細菌屬、種及亞種的差異.脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，是生物體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，已被成功的用于細菌屬、種和亞種的鑒定（Abel et al.,1963;Athalye et al.,1985;Bernard et al.,1991;張國賞等，2000;劉志輝等，2005）.如葡萄球菌屬（Staphylococcus）含有19：0ISO、19：0ANTEISO和C20：0而區(qū)別于微球菌屬（Micrococcus）（Coloe et al.,1986）.本研究利用脂肪酸生物標記分析技術(shù)，分析水葫蘆內(nèi)生細菌的特殊類型脂肪酸，共有6個特殊類型脂肪酸生物標記為6種內(nèi)生細菌的特異性生物標記，如Arthrobacter ureafaciens特異性生物標記為13：0 ANTEISO（1.86%），Bacillus pumilus特異性生物標記為 ISO 17：1 W10C（4.49%），Bacillus sphaericus特異性生物標記為16：1W7C ALCOHOL（11.61%），Nocardia nova特異性生物標記為16：0 10 METHYL（0.66%），Rhizobium rubi特異性生物標記為16：0 3OH（4.13%），Rhodococcus rhodnii特異性生物標記為17：0 10 METHYL（4.23%）.

Coloe等（1986）成功利用細胞脂肪酸技術(shù)分析多株來源于人類和動物體分離的空腸彎桿菌（Campylobacter jejuni）.C18：1到 C19：0cys的比率用于代表分離的3個類群，結(jié)果，來源于人類的85%菌株和源自動物的56%菌株可分別代表各自的群體.如，來源于人類的菌株中，分屬于類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的菌株C18：1的含量分別為14、21和37%，而C19：0cys的含量分別為41%、43%和48%（Coloe et al.,1986）.本研究選擇5株微桿菌屬細菌，以菌種為指標，以脂肪酸生物標記為樣本，構(gòu)建矩陣，以歐氏距離為聚類尺度，用最短距離法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析.可將微桿菌屬的脂肪酸生物標記分為3類，第1類包括了4個脂肪酸生物標記，即16：0、15：0 ISO、17：0 ISO和14：0 ISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種細菌中含量極低或為零.第2類包括了2個脂肪酸生物標記，即17：0 ANTEISO和16：0 ISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種細菌中含量較高，分布比例較均衡.第3類包括1個脂肪酸生物標記，即15：0 ANTEISO，其特點為這些生物標記在微桿菌屬不同種的細菌中較高且分布均衡.

利用脂肪酸生物標記技術(shù)，檢測到水葫蘆內(nèi)生細菌27個有效脂肪酸生物標記，這些生物標記分為4種類型：（1）高頻次分布：在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)13～22次，屬于這些生物標記 的 是 16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO、16：0 ISO，表明這些生物標記可以用于代表細菌總體類群.（2）中頻次分布：在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)5～7次，屬于這些生物標記的是17：0 ISO、14：0 ISO、18：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH、14：0，表明這些生物標記可以用于代表細菌屬類群，如12：0 3OH生物標記，指示著假單胞菌屬.（3）低頻次分布：在被測的25種細菌中，該類生物標記出現(xiàn)2～4次，屬于這些生物標記的 是 12：0 2OH、10：0 3OH、18：1 W9C、17：0 CYCLO、TBSA 10ME18：0、17：0、17：1 W8C、15：1 ANTEISO A、16：1 W11C，表明這些生物標記可以用于代表特定細菌種間差異，如15：1 ANTEISO A生 物 標 記 在 Cellulomonasflavigena和 Kocuria kristinae中有分布，其他種類沒有分布.（4）微頻次分布：脂肪酸生物標記在被測的25細菌中出現(xiàn)在一個細菌中，屬于這些生物標記的是 ISO 17：1 W10C、13：0 ANTEISO、16：0 10 METHYL、16：0 3OH、16：1 W7C ALCOHOL、17：0 10 METHYL，表明可以用于代表細菌特征性生物標記.

利用脂肪酸生物標記技術(shù)，可將分離鑒定的水葫蘆內(nèi)生細菌分為3類，第一類包括4個菌株，這類細菌均含有特征脂肪酸生物標記18：1 W9C.第二類包括4個菌株，菌株主要脂肪酸生物標記為16：0、18：1 W7C、12：0、12：0 3OH和17：0 CYCLO.第三類包括2個菌株，菌株特征脂肪酸生物標記為18：1 W7C.第四類包括15個菌株，這類菌株主要的脂肪酸生物標記為 16：0、15：0 ANTEISO、15：0 ISO、17：0 ANTEISO和16：0 ISO.

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CharacteristicsofPLFA BiomarkersfortheEndophyteBacteria inside Eichhornia crassipe（Mart.）Solms

LAN Jiang-lin，LIU Bo*，ZHU Yu-jing，LIN Ying-zhi，GE Ci-bin，LIU Yun
Agricultural Bioresource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003

1673-5897（2010）2-242-13

X522

A

劉波，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)和微生物農(nóng)藥研究.

2009-05-23 錄用日期：2009-07-15

福建省發(fā)改委項目（閩發(fā)高技［2005］1061號）；省財政專項-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)基金（No.STIF Y03）

藍江林（1972─），副研究員，E-mail:lanfz2008@163.com；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:fzliubo@163. com