莊麗麗，馬梅，饒凱鋒，王東紅，陳玉成

1.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400715

2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

天津市污水以及再生水處理過程中的雌/孕激素干擾效應

莊麗麗1，2，馬梅2，*，饒凱鋒2，王東紅2，陳玉成1

1.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400715

2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

應用重組基因酵母檢測了天津市4個污水處理廠以及2個再生水廠13個水樣的雌/孕激素干擾效應.其中3個污水處理廠的進水檢出了雌激素誘導活性，最高檢測值為10.7ngEEQ·L-1；所有水樣均未檢測出孕激素誘導活性，但都檢測出不同程度的孕激素抑制活性，其中檢出了雌激素誘導活性的污水處理廠的進水具有相對較強的孕激素抑制活性.4個污水處理廠均不能完全去除孕激素抑制活性物質，去除率在44%～78%之間.微濾和臭氧氧化兩種工藝結合對孕激素抑制活性物質的去除效率略優(yōu)于MBR反應器.2個再生水廠出水加氯后孕激素抑制活性均有所增強.關鍵詞：重組基因酵母；污水處理廠；再生水廠；雌激素；孕激素

1 引言（Introduction）

雌/孕激素干擾物是兩種重要的內分泌干擾物質（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs），近年來，在河流、湖泊、海洋等天然水體中均檢測出不同濃度的雌/孕激素干擾物，而城市污水處理廠以及再生水廠被認為是這兩種內分泌干擾物的重要來源之一（王曉祎等，2009）.因此，檢測城市污水處理廠及再生水廠水體中的雌/孕激素干擾效應，并對水廠不同處理段工藝進行評價，對預防大量內分泌干擾物進入環(huán)境具有重要意義.

重組激素受體基因酵母測試方法是目前世界各國普遍采用的定量檢測環(huán)境激素效應的有效方法之一.當酵母與環(huán)境樣品暴露后，酵母中的激素受體基因被具有相應激素活性的物質激活，從而在蛋白質轉錄和合成過程中報道基因也同時被激活，轉錄成β-半乳糖苷酶，通過測定β-半乳糖苷酶的活性可檢測出環(huán)境樣品的類激素活性（李劍等，2008）.本文應用重組人雌激素受體（hER）基因酵母以及重組人孕激素受體（hPR）基因酵母對天津市4個污水處理廠以及2個再生水廠不同工藝段的水樣進行了雌/孕激素干擾效應的檢測，以期對我國北方重要城市水廠的內分泌干擾效應有一個初步的了解.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 樣品采集和前處理

2009年7 月采集4個污水處理廠（A、B、C、D）以及2個再生水廠（E、F）的13個水樣各4L，水樣及其編號如下：A-I：A廠進水；A-E：A廠出水；BI：B廠進水；B-E：B廠出水；C-I：C廠進水；C-E：C廠出水；D-I：D廠進水；E-I：E廠進水；E-O：E廠臭氧氧化后的出水；E-Cl：E廠加氯后出水；F-I：F廠進水；F-M：F廠經膜生物反應器（MBR）后的出水；F-Cl：F廠加氯后出水.其中，E廠進水即D廠出水（E-I=D-E）.再生水廠（E、F）的主要工藝如圖1所示.

圖1 再生水廠E和F的主要工藝及采樣點Fig.1Main technology and sampling points of reclaimed water plants

水樣前處理方法參考文獻（李娜等，2007;駱堅平等，2006）進行，水樣經玻璃纖維素膜（APFF，MILLIPORE，USA）過濾后用HLB柱（500mg，OASIS，USA）富集.以5mL的甲醇/水（甲醇%=5%）清洗HLB柱，然后分別以5mL正已烷/二氯甲烷（體積比為1:1）和10mL甲醇/二氯甲烷（體積比為1:9）為淋洗劑洗脫，合并洗脫液進行旋蒸，高純氮氣吹干后用DMSO定容.

2.2 重組基因酵母檢測法

重組人雌激素受體（hER）基因酵母為本實驗室自行構建（李劍等，2008），培養(yǎng)基為SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基.重組人孕激素受體（hPR）基因酵母由Gaido教授贈送，培養(yǎng)基為補充CuSO4、腺嘌呤、賴氨酸、色氨酸的SC培養(yǎng)基（李劍，2006a）.酵母添加15%甘油后以1mL分裝于EP管中，-80℃保存，培養(yǎng)基于4℃保存（陳月華等，2010）.

酵母測試方法參考文獻（李劍等，2006b）.取1mL新鮮凍融的酵母接種到30mL培養(yǎng)基中，30℃、150rpm培養(yǎng)24h，分光光度計檢測600nm處的吸光度（OD600），培養(yǎng)基稀釋菌液使其OD600為0.75.檢測誘導效應時，取995μL酵母菌液和5μL樣品混勻；檢測抑制效應時，取990μL酵母菌液、5μL樣品以及5μL陽性對照混勻，檢測雌激素效應陽性對照為雌二醇（E2，2×10-10mol·L-1），檢測孕激素效應陽性對照為孕酮（PG，1×10-9mol·L-1）.然后取200μL混合液于96孔板中，恒溫平板搖床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）30℃、800rpm暴露培養(yǎng)2h.以上均為無菌操作.酶標儀（TECAN A-5082，Austria）測定OD595，從96孔板中吸去150μL菌液，加入120μL分析緩沖液（每100mL基礎緩沖液加入3.33mL濃度為0.1%的SDS溶液和270μL的β-巰基乙醇；基礎緩沖液：21.51g的Na2HPO4·12H2O、6.22g的NaH2PO4·12H2O、0.75g的KCl和0.25g的MgSO4·7H2O溶于1L的超純水中），平板搖床上預培養(yǎng)10min后加入20μL三氯甲烷1200rpm破碎細胞10min.然后加入40μL反應底物（ONPG，4mg·mL-1，溶于基礎緩沖液）啟動酶反應，反應完成后加入100μL濃度為1mol·L-1的碳酸鈉溶液固定反應.吸取200μL到酶標板中測定OD420.為保證實驗數據的可靠性，所有樣品均3次重復.

為避免樣品對酵母產生細胞毒性作用而出現假陽性或假陰性的結果，在酵母與樣品暴露2h后，比較樣品與陰性對照（DMSO代替待測樣品）的OD595，若存在顯著差異，說明樣品對酵母有細胞毒性作用.

2.3 數據分析

β-半乳糖苷酶活性u值的計算：

式中，u為β-半乳糖苷酶活性（U）；OD′420為陰性對照在420nm處的吸光度值；OD420和OD595為樣品在420nm和595nm處的吸光度值；V為測試用的菌液體積（mL）；t為反應時間（min）；D為稀釋因子.

樣品的激素干擾效應用抑制率以及誘導率來表征：

式中，u（s）為樣品誘導酵母產生的酶活性；u（p）為陽性對照（E2、PG）誘導酵母產生的酶活性（陳月華等，2010）.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 樣品雌激素干擾效應檢測

3.1.1 E2對重組雌激素受體基因酵母酶活性誘導的劑量-效應關系

本實驗室以往研究已證明本實驗所用的重組人雌激素受體基因酵母對E2有專一性的結合（李劍等，2008）.

將酵母暴露到不同濃度的E2溶液中，檢測誘導產生的酶活性，建立E2對酶活性誘導的劑量-效應關系曲線（圖2）.結果表明，重組雌激素基因酵母對E2有較高的靈敏度，EC50值為7.6×10-11mol·L-1，與本實驗室以往報道結果一致（李劍等，2008）.

3.1.2 樣品的雌激素受體誘導效應檢測

應用重組雌激素受體基因酵母對全部13個水樣進行雌激素誘導效應檢測，結果如表1，污水處理廠A、C、D的進水檢出了雌激素誘導活性，E2當量值（EEQ）分別為10.7、3.0和9.9ng·L-1，其它水樣均未檢出雌激素誘導活性.

圖2 E2對重組雌激素受體基因酵母酶活性誘導的劑量-效應關系曲線Fig.2The induction dose response curve of recombinant human estrogen（hER）gene yeast induced by E2

表1 污水處理廠以及再生水廠水樣的雌激素誘導活性Table 1Estrogen inductive activity of all water samples from sewage and reclaimed water plant

表2為國內外其它研究對于污水處理廠進出水雌激素誘導活性的檢測結果.可以看出，本研究所檢出的進出水雌激素誘導活性在所列研究中處于較低水平.

表2 國內外不同污水處理廠進出水雌激素誘導活性比較Table 2Comparison of estrogen inductive activity of influents and effluents of different waste water treatment plants at home and abroad

3.2 樣品孕激素干擾效應檢測

3.2.1 PG對重組孕激素受體基因酵母酶活性誘導的劑量-效應關系

本實驗室以往研究已證明本實驗所用的重組人孕激素基因酵母對PG有專一性的結合（李劍等，2006a;2006b）.

將酵母暴露到不同濃度的PG溶液中，檢測誘導產生的酶活性，建立PG對酶活性誘導的劑量-效應關系曲線（圖3）.結果表明，重組孕激素基因酵母對PG有較高的靈敏度，EC50值為1.2×10-9mol·L-1，與本實驗室以往報道結果類似（李劍等，2006a;2006b）.

圖3 PG對重組孕激素受體基因酵母酶活性誘導的劑量-效應關系曲線Fig.3The induction dose response curve of recombinant human progesterone（hPR）gene yeast induced by PG

3.2.2 樣品的孕激素受體誘導效應檢測

應用重組孕激素受體基因酵母對全部13個水樣進行孕激素誘導效應檢測，結果見圖4，所有水樣均未檢出對孕激素受體酵母的誘導活性（誘導率低于10%認為無誘導活性）.

3.2.3 4個污水處理廠水樣的孕激素受體抑制效應檢測

應用重組孕激素受體基因酵母檢測4個污水處理廠進水和出水共8個水樣的孕激素抑制效應，結果如圖5所示，污水處理廠A和D的污水總進水表現出較強的孕激素抑制活性，抑制率高達89.8%和84.7%，污水處理廠B和C的污水總進水孕激素抑制率也達到56.7%和53.1%.

圖4 污水及再生水廠水樣對孕激素酵母酶活性的誘導率Fig.4Inductivity of PR activity of all water samples from sewage and reclaimed water plants

圖5 污水處理廠進出水對孕激素酵母酶活性的抑制率Fig.5Inhibition of PR activity of influents and effluents of sewage treatment plants

污水處理廠A的服務區(qū)域經濟以工業(yè)為主，農業(yè)為輔，包括大型農業(yè)生產基地，該水廠主要承接工業(yè)廢水及農業(yè)廢水.農業(yè)中大量使用的農藥如DDT、硫丹、林丹等是典型的具有孕激素抑制活性的化合物（Mckinlay et al.,2008;Marie et al.,2004）.此外，工業(yè)廢水中也含有較多的孕激素抑制活性物質，如Chatterjee等（2008）對皮革制造業(yè)的水樣檢測中發(fā)現了大量具有孕激素抑制活性的化合物.該水廠承接大量含有上述化合物的污水可能是導致其進水具有較強孕激素抑制活性的主要原因.污水處理廠D的服務區(qū)人口密集，為該市商貿、金融、醫(yī)療中心，包括較為發(fā)達的工業(yè)區(qū)，該水廠承接污水來源廣泛，導致進水孕激素受體抑制活性較強.

有研究證明，環(huán)境內分泌干擾物對生物體內孕激素受體表達的抑制可使雌激素受體的表達增強，從而表現出類雌激素效應（Kraus et al.,1995）.如李劍等人對酚類物質以及有機氯農藥的內分泌干擾效應檢測中發(fā)現，4-t-OP（4-t-辛基酚）、3,4-DCP（3,4-二氯酚）、PCP（五氯酚）、4-Phenylphenol（4-苯基苯酚）、P,P′-DDE和P,P′-DDT等化合物同時具有孕激素受體抑制活性和雌激素受體誘導活性，且在相對較低濃度下即表現出孕激素受體抑制活性，當化合物濃度增大1到4個數量級時，表現出雌激素受體誘導活性（Li et al.,2008;2009）.此外，某些內分泌干擾物如2-tertbutylphenol（2-t-丁基酚）、2-Isopropylphenol（2-異丙基酚）以及r-HCH等只具有孕激素受體抑制活性而不具有雌激素受體誘導活性（Li et al.,2008;2009）.可能由于上述化合物在污水中的廣泛存在，使具有相對較強孕激素受體抑制活性的污水處理廠A、C、D的進水檢出了雌激素受體誘導活性，而污水處理廠B的進水雖檢出較強孕激素受體抑制活性但未檢出雌激素誘導活性（表1和圖5）.

污水處理廠A、B、C、D對于具有孕激素抑制活性化合物的去除率（（進水抑制率-出水抑制率）/進水抑制率×100%）分別為75.5%、63.0%、77.8%和43.6%，除污水處理廠D外，其余水廠去除效果均較好，出水抑制率降至22%以下.所有污水廠對孕激素抑制劑均不能完全去除.

3.2.4 兩個再生水廠水樣的孕激素受體抑制效應比較

圖6顯示兩個再生水廠不同處理段對重組孕激素酵母酶活性的抑制率.由圖6可見，水樣在加氯前孕激素酵母活性抑制率顯著下降；而加氯后出水孕激素酵母活性抑制率又顯著升高.

圖6 再生水廠不同處理段對孕激素酵母酶活性的抑制率Fig.6Inhibition ratios of PR activity of reclaimed water plants samples

再生水廠E主要采用“混凝-沉淀+微濾+臭氧氧化+氯氣消毒”的處理工藝.常規(guī)的“混凝-沉淀”可較好地去除大分子有機物以及非溶解性色度（余國忠和栗印環(huán)，2002）.微濾膜主要截留污水中的顆粒物、細菌以及大分子有機物，而大量溶劑、小分子以及部分大分子有機物則能透過微濾膜.一般來說，內分泌干擾物這類小分子有機物可以通過微濾膜而不被截留，但某些內分泌干擾物為疏水性化合物，可由吸附作用附著在膜的表面，從而達到分離的目的（Yoon et al.,2004）.Gomez等人（2007）的研究也證明，內分泌干擾物可被吸附到顆粒物的表面，從而被膜所截留.王曉東等人（2006）的研究發(fā)現，臭氧氧化可部分去除飲用水中的壬基酚（NP）等酚類物質.此外，對于殺蟲劑如阿特拉津（Hua et al.,2006）、滅多威（李紹峰等，2007）等內分泌干擾物，臭氧也有較好地去除效果.由于微濾和臭氧氧化對于內分泌干擾物都有不同程度的去除，使得水樣在加氯前，孕激素酵母酶活性的抑制率顯著降低.

再生水中含有較多的脂肪族化合物以及有機氯和鹵素（Tanita and Kimberly,2005），氮、氯取代的芳香性和脂肪族物質是氯消毒副產物重要的前體物質（郭瑾和彭永臻，2007）.再生水廠的前處理一般可將大分子的消毒副產物前體物質去除.臭氧的強氧化性能夠破壞消毒副產物前體物的雙鍵結構，從而抑制鹵素與雙鍵的加成或取代反應，但是，臭氧在氧化大分子有機物的同時，也產生了含有醛和酮結構的小分子有機物，這類有機物也是較強的消毒副產物前體物質（陳超等，2005）.這可能導致了水廠出水在加氯后有氯消毒副產物生成，而有文獻證明該類物質具有內分泌干擾效應（胡建英和楊敏，2001），從而導致再生水廠E出水的孕激素抑制活性顯著增強.

再生水廠F的主要處理工藝為：曝氣沉砂池+MBR反應器+氯氣消毒.曝氣沉砂池主要去除污水中的無機顆粒、油脂類物質以及少量的有機污染物（王棟等，2006），對孕激素抑制劑去除效率貢獻不大.膜生物反應器（MBR）是結合膜分離和生物處理方法的聯合技術.再生水廠F水樣經MBR反應器后，對孕激素酶活性的抑制率降低了32.1%，遠低于臭氧氧化（再生水廠E）.有研究顯示，在MBR反應器缺氧池中，壬基酚聚氧乙烯醚大量降解為壬基酚，其轉化率大于壬基酚在污泥中吸收和降解的速率（Hu et al.,2007），且壬基酚是典型的孕激素抑制劑，這可能是MBR反應器對孕激素抑制活性物質處理效果不佳的一個原因.

與再生水廠E的檢測結果相同，再生水廠F出水在加氯后，孕激素抑制活性也有所增強.由此可以推斷，后加氯工藝是導致水廠出水具有較高孕激素抑制活性的主要原因.

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EstrogenandProgesteroneInterferenceEffectofSewageand Reclaimed Water Treatment Process in Tianjin

ZHUANG Li-li1，2，MA Mei2，*，RAO Kai-feng2，CHEN Yu-cheng1

1.College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Science,Beijing 100085

Recombinant gene yeast was used to detect estrogen and progesterone interference effect of thirteen water samples from four sewage treatment plants and two reclaimed water plants in Tianjin.Estrogen inductive activity was detected in the influents of three sewage treatment plants,with the highest 17β-estradiol equivalents（EEQ）of 10.7ng·L-1.And all the water samples had no progesterone inductive activity,but progesterone inhibiting activity.And the water samples which were detected estrogen inductive activity had higher progesterone inhibiting activity correspondingly.All the sewage treatment plants could not wipe off the progesterone inhibitors totally,with the removal rates between 44%and 78%.The removal rate of progesterone inhibitors by microfiltration and ozonation was superior to that by MBR.The inhibition ratios of effluents of reclaimed water plants increased after chlorination.

recombinant gene yeast；waste water treatment plant；reclaimed water plant；estrogen；progesterone

8 January 2010accepted10 February 2010

1673-5897（2010）2-222-07

X882.5，X131.3

A

2010-01-08錄用日期：2010-02-10

國家高技術研究發(fā)展計劃（863）探索導向項目（No.2007AA06Z414）；水體污染控制與治理科技重大專項（No.2008ZX07314-003）；天津市科技創(chuàng)新專項資金項目（No.06FZZDSH00900）

莊麗麗（1984—），女，碩士研究生，E-mail:lili3425@163.com；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:mamei@rcees.ac.cn

馬梅（1967—），女，博士，中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室研究員，博士生導師，主要研究方向為水生態(tài)毒理學.