陳霞，石維忱，翟明昌，姚峻，莫新迎，韓丹，趙長(zhǎng)新，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國(guó)發(fā)酵工業(yè)協(xié)會(huì)，北京100833）

響應(yīng)面優(yōu)化大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的提取條件

陳霞1，石維忱2，翟明昌1，姚峻1，莫新迎1，韓丹1，趙長(zhǎng)新1，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國(guó)發(fā)酵工業(yè)協(xié)會(huì)，北京100833）

利用響應(yīng)面分析法考察緩沖液提取大麥熱穩(wěn)定蛋白的浸提時(shí)間、液料比和浸提溫度對(duì)大麥中熱穩(wěn)定蛋白含量的影響。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到，其最佳浸提溫度為20.126℃，液料比為6.437∶1（mL/g），浸提時(shí)間為119.326 min，此時(shí)通過緩沖液提取得到的熱穩(wěn)定蛋白含量為2.189 mg/g。

熱穩(wěn)定蛋白；大麥；響應(yīng)面分析

Abstract:Heat-stable proteins of barley play a major role in the formation,stability,and texture of head foams.With response surface methodology,we investigated that temperature，extract time and extract water had an effect on the contents of heat-stable proteins in the barley.The results showed that the optimum conditions of heat-stable proteins are ：extract temperature 20.126 ℃,ratio of material to water 6.437∶1（g/mL），extract time 119.326 min，the highest extracting purity is 2.189 mg/g.

Key words：barley;heat-stable proteins;response surface analysis

大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的重要原料，其蛋白質(zhì)組成和含量是決定啤酒品質(zhì)的重要因素。大麥中的熱穩(wěn)定蛋白能夠經(jīng)過發(fā)芽、糖化以及煮沸發(fā)酵等過程后仍然得以保存[1-2]，成為決定啤酒口感、風(fēng)味、泡沫及膠體穩(wěn)定性等品質(zhì)指標(biāo)[3]。蛋白質(zhì)Z和LTP1（磷脂轉(zhuǎn)移蛋白）是大麥熱穩(wěn)定蛋白中的主要組分，蛋白質(zhì)Z主要的胚乳清蛋白（占清蛋白總量的5%左右），能夠增強(qiáng)泡沫的穩(wěn)定性并可能與啤酒泡沫冷渾濁的生成有關(guān)[4]，LTP1是糊粉層中的小分子球蛋白，分子量約10 ku，可能是種子的淀粉酶和蛋白酶的抑制劑（probable amylase/protease inhibitor,PAPI）。在釀造過程中，熱穩(wěn)定蛋白分子的大小和構(gòu)象上發(fā)生的變化增強(qiáng)了其泡沫活性[5]，因此對(duì)大麥及啤酒中熱穩(wěn)定蛋白的研究越來越多并受到廣泛的關(guān)注[6]。由于大麥中熱穩(wěn)定蛋白含量相對(duì)不高，因此本文以大麥為原料，利用響應(yīng)面分析法對(duì)大麥中熱穩(wěn)定蛋白的提取條件的顯著因子進(jìn)行探索，確定了最佳的提取條件，減少了提取熱穩(wěn)定蛋白的損失，為啤酒生產(chǎn)及熱穩(wěn)定蛋白的研究提供可靠的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大麥：Gairdner（澳大利亞產(chǎn)），由中糧麥芽（大連）有限公司惠贈(zèng)。

試劑為 DTT：Merk、EDTA·Na2：Sigma、考馬斯亮藍(lán) G250/R250、牛血清蛋白、Tris、HCl、NaCl試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Unic-7200分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Hitachi-G21高速離心機(jī)：上海尤尼柯儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋：鞏義市英山谷予生化儀器廠；可調(diào)萬用電爐：山東省龍口市先科儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取

熱穩(wěn)定蛋白的提取流程：大麥→粉碎→稱量→提取緩沖液浸提→高速離心→上清液→大麥熱穩(wěn)定蛋白提取液。

大麥用干磨機(jī)磨碎3 min，準(zhǔn)確稱取1 g（扣除水分后的絕干重量），加入一定體積的20℃提取緩沖液（Tris-Cl 50 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，DTT 1 mmol/L，EDTA·Na21 mmol/L，pH7.5），搖勻，置一定溫度下提取相應(yīng)時(shí)間，其間每10 min搖振1次。2800×g離心10 min，棄去沉淀，上清液即為大麥熱穩(wěn)定蛋白粗提取液。將此粗提液在置于100℃沸水浴中20 min，之后4000×g離心15min，所得上清液為熱穩(wěn)定蛋白提取液[7]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

Bradford法，使用的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[8]，濃度單位：mg/mL。

1.3.3 試驗(yàn)單因素條件選取

浸提溫度為 4、8、12、16、20、24 ℃，液料比為 3、4、5、6、7、8 mL/g，浸提時(shí)間為 30、60、90、120、150、180 min進(jìn)行試驗(yàn)，每組蛋白提取液通過1.3.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定，觀察對(duì)大麥中熱穩(wěn)定蛋白提取量的影響。

1.3.4 提取條件的進(jìn)一步優(yōu)化方法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步確定最佳熱穩(wěn)定蛋白的提取條件，本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)的3個(gè)因素為試驗(yàn)因子，以蛋白含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定提取熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)得率的最佳條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 液料比對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

在浸提時(shí)間為120 min，浸提溫度為20℃條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關(guān)系，結(jié)果如圖1。

由圖1可知：在液料比小于6 mL/g時(shí)，熱穩(wěn)定蛋白的提取量隨液料比的增大顯著升高，當(dāng)液料比為6 mL/g時(shí)，大麥熱穩(wěn)定蛋白含量達(dá)最高值，大麥熱穩(wěn)定蛋白浸提充分，所以繼續(xù)升高液料比，其浸提含量基本不變。所以，單因素試驗(yàn)最佳選液料比為6 mL/g，并以此對(duì)其它提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2 浸提時(shí)間對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

在浸提溫度為20℃，液料比為6 mL/g條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關(guān)系，結(jié)果如圖2。

圖1 液料比對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響Fig.1 Effects of the heat-stable proteins versus different extract water to material rate

圖2 浸提時(shí)間對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響Fig.2 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time

由圖2可見,在浸提時(shí)間小于120 min時(shí),熱穩(wěn)定蛋白的提取量提高比較顯著,在120 min～180 min內(nèi)，熱穩(wěn)定蛋白含量變化不大。可能由于提取液破壞了細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)等物質(zhì)流出細(xì)胞并溶于提取液中，隨著浸提時(shí)間的變化，熱穩(wěn)定蛋白溶于提取液中的含量也不斷升高，當(dāng)?shù)鞍壮浞秩芙鈺r(shí)，浸提時(shí)間不再對(duì)其溶解量有影響，熱穩(wěn)定蛋白含量基本不變。因此根據(jù)圖2，單因素試驗(yàn)最佳浸提時(shí)間為120 min，以此對(duì)浸提溫度進(jìn)行確定。

2.3 浸提溫度對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響

在浸提時(shí)間為120 min，提取液體積為5 mL條件不變的情況下，考察蛋白含量隨浸提溫度的變化關(guān)系，如圖3。

由圖3可見，隨著浸提溫度的不斷變化，大麥熱穩(wěn)定蛋白的提取量變化較大，溫較低于12℃，蛋白含量增幅不大；當(dāng)浸提溫度為20℃時(shí)，熱穩(wěn)定蛋白含量最高為1.686 mg，是16℃的1.14倍。因此單因素試驗(yàn)最佳浸提溫度條件為20℃。

圖3 浸提溫度對(duì)熱穩(wěn)定蛋白含量的影響Fig.3 Effects of the heat-stable proteins versus different extract temperature

2.4 響應(yīng)面法對(duì)大麥熱穩(wěn)定蛋白提取條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量,以熱穩(wěn)定蛋白提取量為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析 (response surface analysis,RSA)，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Level of factors chosen for the trials

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result s of RSM analysis

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,以提取熱穩(wěn)定蛋白的量為因變量，浸提溫度(X1)、提取液體積(X2)和浸提時(shí)間(X3)為自變量建立回歸方程如下：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression eqution

熱穩(wěn)定蛋白的提取量與試驗(yàn)3個(gè)因素的回歸方程的F=145.81,P＜0.01,方程顯著?；貧w方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9894，說明因變量與3個(gè)自變量之間的線性關(guān)系顯著。

回歸方程的方差分析見表4。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

從方差4分析表中可以看出，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的，交互項(xiàng)作用影響不顯著，故交互項(xiàng)可以省略，也可以看出各具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[9]。

圖4～圖6直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。比較3圖可知，浸提溫度和液料比對(duì)大麥熱穩(wěn)定蛋白的提取率影響比浸提時(shí)間的影響更為顯著。

圖4 浸提溫度和液料比對(duì)熱穩(wěn)定蛋白提取量的影響Fig.4 Effects of the heat-stable proteins versus different extract temperature and water to material rate

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，可得到3個(gè)方程，y=2.18933-0.57979X21-0.20547X22-0.05604X32+0.121X1+0.08737X2-0.03238X3-0.03250X1X2-0.009X1X3-0.00975X2X3

圖5 浸提時(shí)間和液料比對(duì)熱穩(wěn)定蛋白提取量的影響Fig.5 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time and water to material rate

圖6 浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)熱穩(wěn)定蛋白提取量的影響Fig.6 Effects of the heat-stable proteins versus different extract time and temperature

聯(lián)立方程組（1）、（2）、（3） 解得 X1＝0.12649、X2＝0.4372、X3=-0.67418提取熱穩(wěn)定蛋白的最佳條件為：浸提溫度為20.126℃、液料比為6.437 mL/g、浸提時(shí)間為119.326 min，由回歸方程確定熱穩(wěn)定蛋白的最大提取量為2.193 mg。采用響應(yīng)面分析法求得的最佳條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn),結(jié)果得出實(shí)際提取量為2.186 mg，平均誤差為0.319%，與理論預(yù)測(cè)值基本相符。因此，利用響應(yīng)面分析法得到的提取條件是可靠的，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，對(duì)大麥熱穩(wěn)定蛋白的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，分析確定大麥熱穩(wěn)定蛋白的最佳提取條件：浸提溫度為20.126℃、提取液體積為6.437 mL、浸提時(shí)間為119.326 min。

大麥?zhǔn)瞧【频闹饕?，其中大麥中的熱穩(wěn)定蛋白被公認(rèn)為是啤酒泡沫的重要組成成分[10]，具有相當(dāng)高的研究?jī)r(jià)值。本研究是對(duì)熱穩(wěn)定蛋白研究的補(bǔ)充，具有較高應(yīng)用價(jià)值，為大麥中的熱穩(wěn)定蛋白的進(jìn)一步研究提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

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Optimization of Extraction Technology Condition of Heat-stable Proteins from Barley Using Response Surface Methodology

CHEN Xia1，SHI Wei-chen2，ZHAI Ming-chang1，YAO Jun1，MO Xin-ying1，HAN Dan1，ZHAO Chang-xin1,*
（1.School of Bio＆ Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning,China；2.Fermentation Industry Association of China，Beijing 100833,China）

2010-04-21

國(guó)家“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007BAK36 B01)

陳霞(1983—)，女（滿），在讀碩士研究生，研究方向：釀造大麥中熱穩(wěn)定蛋白的研究。

*通信作者：趙長(zhǎng)新(1955—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)酵機(jī)理和大麥蛋白組學(xué)。