王菲，欒云峰，劉長(zhǎng)江，孫曉榮

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助提取軟棗獼猴桃黃酮

王菲，欒云峰，劉長(zhǎng)江*，孫曉榮

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

為優(yōu)化軟棗獼猴桃黃酮微波提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、微波功率和提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以軟棗獼猴桃總黃酮提取率為響應(yīng)值，使用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化微波提取工藝，并確定微波輔助提取軟棗獼猴桃總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度76%、提取時(shí)間6 min、微波功率300 W。在此條件下，實(shí)際提取率為0.322 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本吻合。

軟棗獼猴桃；黃酮化合物；微波輔助提取；響應(yīng)曲面法

Abstract:In this study,optimum condition of microwave-assisted extraction of Actinidia arguta is optimized by response surface test.On the basis of single-factor test,the mathematical regression model is established on the dependent variable（extraction yield of Actinidia arguta flavonoids)and independent variables（ethanol concentration,microwave power and extraction time)by Box-Benhnken center composite design and response surface methodology.The optimum extraction conditions are as follows：ethanol concentration 76%,extraction time 6 min,microwave power 300 W.Under these conditions,the yield of Actinidia arguta flavonoids is 0.322 mg/g,consistent with the prediction value.

Key words：Actinidia arguta；flavonoids;microwave-assisted extraction;response surface methodology

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Sieb.et Zucc.），又名軟棗子，獼猴梨，藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物[1]。果實(shí)可食用，多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨(dú)特。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含大量VC、B族維生素、氨基酸、類胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。黃酮類化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[2]。對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抵御異物的侵襲起著重要作用。黃酮化合物有具有廣泛的藥理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用[3]。

傳統(tǒng)的黃酮提取方法有浸提法、索氏法和回流法等[4]，近年來(lái)在提取工藝方面引入了一些新方法如酶法提取、微波提取、超聲提取等。微波輔助提取法是利用每秒幾億次周期變化的微波透入物料內(nèi)，使物料內(nèi)各部分在同一瞬間獲得能量而達(dá)到提取植物有效成分的目的，具有高效性、強(qiáng)選擇性、操作簡(jiǎn)便、提取成本低等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，已被廣泛應(yīng)用于植物有效活性成分提取。

目前，對(duì)于軟棗獼猴桃的活性成分研究進(jìn)行較少，對(duì)其中活性成分提取罕有報(bào)道。采用微波輔助提取，二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析的方法，對(duì)軟棗獼猴桃中黃酮類化合物的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳提取工藝，為軟棗獼猴桃黃酮類化合物的利用提供科學(xué)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃：遼寧省本溪市；蘆丁（rutin）化學(xué)對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；其他試劑均為分析純。

TU-180型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；Eppendorf移液器：德國(guó)；Himac CR－21G高速冷凍離心機(jī)：日本日立；BP120S電子天平：德國(guó)sartorius；MAS-I常壓微波萃取儀：上海新儀微波微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 軟棗獼猴桃黃酮提取及測(cè)定方法

軟棗獼猴桃鮮果洗凈，吸干表面水分，勻漿，準(zhǔn)確稱取10.00 g，以乙醇為提取液進(jìn)行微波輔助提取，提取物4℃，10000 r/min離心15 min，取上清液定容至100 mL。

1.2.2 軟棗獼猴桃提取率計(jì)算

總黃酮測(cè)定方法采用AlCl3比色法[7]對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，然后按下式計(jì)算軟棗獼猴桃總黃酮提取率：

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g軟棗獼猴桃鮮果勻漿，在微波功率200 W、提取溫度40℃、提取時(shí)間3 min、乙醇濃度70%的條件下，討論勻漿與乙醇料液比（g/mL）對(duì)提取率的影響。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g軟棗獼猴桃鮮果勻漿，在料液比1∶4（g/mL）、微波功率 200 W、提取溫度 40 ℃、乙醇濃度70%的條件下，討論提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.2.3.3 微波功率對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g軟棗獼猴桃鮮果勻漿，在料液比1∶4（g/mL）、提取溫度 40 ℃、提取時(shí)間 3 min、乙醇濃度70%的條件下，討論微波功率對(duì)提取率的影響。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g軟棗獼猴桃鮮果勻漿，在料液比1：4（g/mL）、微波功率 200 W、提取時(shí)間 3 min、乙醇濃度70%的條件下，討論提取溫度對(duì)提取率的影響。

1.2.3.5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10.00 g軟棗獼猴桃鮮果勻漿，在料液比1∶4（g/mL）、微波功率 200 W、提取溫度 40 ℃、提取時(shí)間3 min的條件下，討論乙醇濃度對(duì)提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及提取率計(jì)算方法

采用AlCl3比色法，精確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以50%乙醇定容至50 mL，搖勻，得0.2 mg/mL蘆丁溶液。分別取 0、1、2、3、4、5 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 25 mL 比色管，再依次加入8 mL 0.1 mol/L AlCl3和4 mL醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH5.5），以50%乙醇溶液定容至25 mL，靜置20 min，在415 nm處測(cè)定吸光度，并以吸光度A為橫軸，以蘆丁濃度Y（mg/mL）為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖 1），得回歸方程 Y=0.0315A－0.0002，R2=0.9999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of liquid ratio on extraction rate of flavonids

如圖 2 所示，當(dāng)料液比小于 1∶3（g/mL）時(shí)，提取率隨料液比提高而上升，當(dāng)料液比大于 1∶3（g/mL）時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定。

2.2.2 提取溫度對(duì)提取率的影響

提取溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，提取溫度在40℃~70℃范圍內(nèi)，對(duì)提取率的影響很小。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖3 溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of temperate on extraction rate of flavonids

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction rate of flavonids

如圖4所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類化合物的提取率先迅速上升而后迅速下降，在緩慢上升又緩慢下降，在5 min時(shí)達(dá)到最大值。

2.2.4 提取功率對(duì)提取率的影響

微波功率對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 微波功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effects of power on etxraction rate of flavonoids

如圖5所示，當(dāng)微波功率小于300 W時(shí)，隨著微波功率的增加提取率逐漸增大，當(dāng)微波功率大于300 W時(shí)，提取率又逐漸下降。由于不同的提取物有著不同適宜提取的微波功率范圍，超過(guò)此范圍，微波作用可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生降解而使提取率下降[8]。

2.2.5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

乙醇濃度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.6 Effects of ethanol concen tration onex tracti on rate off lavonoids

如圖6所示，提取率在乙醇濃度＜50%時(shí)不穩(wěn)定，在50%～70%范圍內(nèi)，隨乙醇濃度的升高而逐漸增加，乙醇濃度為70%時(shí)提取率最高，在＞70%時(shí)又隨乙醇濃度的升高又急緩慢降低。隨乙醇濃度變化，溶劑極性改變，70%乙醇的極性與軟棗獼猴桃中黃酮類化合物極性相似，但隨著乙醇濃度的升高，脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)大量析出，影響了黃酮類物質(zhì)的浸出[9]。

2.3 提取條件優(yōu)化方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用SAS9.1軟件中的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。各因子代碼值見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Levels and codes of variable

2.3.1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test designs and results

2.3.2 提取率的方差分析

采用SAS9.1.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到軟棗獼猴桃黃酮類化合物的提取率與微波輔助提取各因素變量間的函數(shù)關(guān)系(去掉不顯著項(xiàng))為：

為了說(shuō)明回歸方程的有效性及各因素對(duì)提取率的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行了方差分析，見(jiàn)表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

如表3所示，微波功率和提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物的提取率影響極顯著，乙醇濃度對(duì)提取率影響顯著；二次項(xiàng)對(duì)黃酮類化合物提取率均達(dá)到顯著水平；交互項(xiàng)對(duì)提取率無(wú)影響。此模型的決定系數(shù)R2=0.9955；經(jīng)擬合檢驗(yàn)，p=0.0001＜0.01差異極顯著，說(shuō)明該方程能夠正確反映提取率與乙醇濃度、微波功率和提取時(shí)間之間的關(guān)系。失擬檢驗(yàn)p=0.121663＞0.05，說(shuō)明本試驗(yàn)無(wú)其他因素的顯著影響。

2.3.3 響應(yīng)面分析

將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見(jiàn)圖7～圖9。

圖7 響應(yīng)面法(乙醇濃度、功率)立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.7 Effects of ethanol concentration and power on extraction rate of flavonoids

如圖7所示，提取率對(duì)乙醇濃度的變化比功率的變化敏感；當(dāng)乙醇濃度73%、微波功率300 W附近時(shí)，提取率達(dá)到最大值。

圖8 響應(yīng)面法(時(shí)間、功率)立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.8 Effects of extraction time and power on extraction rate of flavonoids

如圖8所示，提取率對(duì)提取時(shí)間的變化比微波功率的變化更為敏感；當(dāng)提取時(shí)間在5.4 min，微波功率在300 W附近時(shí)，提取率達(dá)到最大值。

圖9 響應(yīng)面法(時(shí)間、乙醇濃度)立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.9 Effects of ethanol concentration and extraction time on extraction rate of flavonoids

如圖9所示，提取率對(duì)乙醇濃度的變化比提取時(shí)間的變化更為敏感；當(dāng)提取時(shí)間為5.3 min，乙醇濃度為73%附近時(shí)，提取率達(dá)到最大值。

2.3.4 最佳工藝參數(shù)

由統(tǒng)計(jì)軟件分析得到，軟棗獼猴桃黃酮類化合物的最佳提取工藝為：乙醇濃度75.61%、提取時(shí)間5.37 min、微波功率318.69 W。此時(shí)黃酮類化合物的理論提取率最大為0.321 mg/g?？紤]實(shí)際操作情況，確定軟棗獼猴桃黃酮類化合物的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度76%、提取時(shí)間6 min、微波功率300 W。

在此條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到提取率分別0.320、0.324、0.322 mg/g，平均值為 0.322 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致，證實(shí)了該模型的有效性。

3 結(jié)論

微波輔助提取軟棗獼猴桃中黃酮類化合物的最佳工藝條件為：乙醇濃度76%、提取時(shí)間6 min、微波功率300 W。在此條件下，黃酮類化合物的提取率為0.322 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致。

微波功率和提取時(shí)間是影響提取率的主要因素，其中提取時(shí)間對(duì)提取率影響最大，其次是微波功率，而乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物的提取率影響相對(duì)較小，并且三因素之間無(wú)交互作用。

[1]趙淑蘭.軟棗獼猴桃品種簡(jiǎn)介[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2002(2)：35

[2]吳立軍.天然藥物化學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：173-184

[3]張培成.黃酮化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2008：227-243

[4]陳業(yè)高.植物化學(xué)成分[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2004：232

[5]李嶸,金美芳.微波法提取銀杏黃酮甙的新工藝[J].食品科學(xué),2000,21(2)：39-41

[6]孫萍,蘭衛(wèi),李艷,等.微波提取肉叢蓉中總黃酮和多糖的含量測(cè)定[J].中草藥,2003,34(6)：1-15

[7]何書美,劉敬蘭.茶葉中總黃酮含量測(cè)定方法的研究[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2007,35(9)：1365-1368

[8]董發(fā)明,白喜婷.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取杜仲雄花中黃酮類化合物的工藝參數(shù)[J].食品科學(xué),2008,29(8)：227-231

[9]樊瑞勝,陳平,劉巖，等.桔皮類黃酮乙醇提取工藝研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,22(4)：97-100

Optimization of Microwave-assisted Extraction Conditions of Actinidia arguta Flavonoids Using Response Surface Methodology

WANG Fei,LUAN Yun-feng,LIU Chang-jiang*,SUN Xiao-rong
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，Liaoning,China）

2010-05-19

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（200903013）

王菲（1982—），女（漢），博士在讀，主要從事食品生物技術(shù)方向研究。

*通信作者：劉長(zhǎng)江（1955—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方向研究。