劉書(shū)亮,吳琦,詹莉,賴文

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安,625014) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命與理學(xué)院,四川雅安,625014)

枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究＊

劉書(shū)亮1,吳琦2,詹莉2,賴文1

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安,625014) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命與理學(xué)院,四川雅安,625014)

對(duì)枯草芽孢桿菌BE M01菌株發(fā)酵液中的彈性蛋白酶進(jìn)行了分離純化,并研究了酶學(xué)性質(zhì)。先后采用了硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析和分子篩層析等方法,彈性蛋白酶的回收率為7.88%,純化倍數(shù)為13.79,結(jié)合SDS-PAGE和分子篩層析確定該彈性蛋白酶是一單鏈蛋白,分子量約為31 ku。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的研究表明,該彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類(lèi);其最適作用溫度為50℃,具有良好的熱穩(wěn)定性;在硼砂-硼酸緩沖體系、Tris-HCl緩沖體系中酶最適反應(yīng)pH分別為7.4和8.6,在pH 8.0～11.0酶活力趨于穩(wěn)定;10 mmol/L的Ca2+有激活和穩(wěn)定酶活作用,SDS和吐溫-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA對(duì)酶活均有不同程度的抑制作用;其催化動(dòng)力學(xué)方程為:y=0.186x+32.493;Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057 g/mL。

彈性蛋白酶,枯草芽孢桿菌,純化,酶學(xué)性質(zhì)

彈性蛋白酶(EC3.4.4.7,Elastase)是一種以水解不溶性彈性蛋白(elastin)為特征的蛋白水解酶[1],主要用作治療高血脂癥和防止動(dòng)脈粥樣硬化癥。同時(shí),其廣譜蛋白水解活性和對(duì)彈性蛋白的優(yōu)先特異降解性顯示其作為肉類(lèi)嫩化劑具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的商業(yè)價(jià)值[1-2]。彈性蛋白酶可從動(dòng)物胰臟中提取或由微生物發(fā)酵制得[3]。我國(guó)該產(chǎn)品的生產(chǎn)主要由胰臟提取,但受胰臟資源的限制,胰彈性蛋白酶供不應(yīng)求。利用微生物生產(chǎn)彈性蛋白酶可為醫(yī)藥和食品工業(yè)提供充足的酶源。近年關(guān)于微生物產(chǎn)彈性蛋白酶的研究已有不少報(bào)道,主要集中在菌種選育、培養(yǎng)條件優(yōu)化以及酶的純化及其特性等方面。研究顯示,不同微生物源的彈性蛋白酶在性質(zhì)上存在一定的差異,分子量從21-39.5 ku不等,其最適pH跨越7.4-11.7等[4-13]?？莶菅堪麠U菌屬于公認(rèn)安全(generally regarded as safe,GRAS)的微生物。本實(shí)驗(yàn)室從屠宰場(chǎng)周?chē)寥乐蟹蛛x篩選并經(jīng)紫外線誘變選育出1株高產(chǎn)彈性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)BEM01[14-15],10L罐發(fā)酵酶活可達(dá)200 U/mL以上。本研究旨在對(duì)菌株BEM01發(fā)酵液進(jìn)行分離純化,對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,為該酶的大規(guī)模制備和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)BEM01,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

彈性蛋白(Elastin);地衣紅-彈性蛋白(Elastinorcein);牛血清白蛋白(BSA),購(gòu)自Sigma公司;胰彈性蛋白酶(酶活120 U/mg),購(gòu)自上海林瑞生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250,購(gòu)自Fluka;透析袋(分子截留量為14 ku)(Spectropor);DEAE-Cellose(Amresco);SephadexG-100(Phamacia);SDS-PAGE試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(%):葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,KH2PO40.2,MgSO4.7H2O 0.01,pH 7.5,121℃滅菌20 min。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):干酪素2.0,葡萄糖2.0,蛋白胨0.2,酵母膏0.2,吐溫-800.01,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O 0.01,CaCl20.01,pH值7.5,121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵上清液制備

挑斜面培養(yǎng)物1環(huán)接種于2 mL種子培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24 h后,取300μL菌液接種于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后按3%的接種量接種于250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24 h,即為種子液,再在RZ-10L發(fā)酵罐中發(fā)酵:裝料系數(shù)0.65,接種量3%,發(fā)酵溫度37℃,起始pH值7.5,轉(zhuǎn)速控制在300 r/min,必要時(shí)加無(wú)菌菜籽油消泡,發(fā)酵至32h放罐,得發(fā)酵液,再于4℃,8000 r/min離心30 min去菌體,得發(fā)酵上清液(粗酶液)。

1.2.2 彈性蛋白酶酶活力的測(cè)定方法

參照我國(guó)現(xiàn)行藥用彈性蛋白酶測(cè)定方法和Sachar[16]進(jìn)行測(cè)定。稱取10 mg地衣紅-彈性蛋白,加入 p H 8.8的 0 .2 mol/L的硼酸緩沖液 2mL,再加入1 mL適當(dāng)稀釋的酶液,于55℃水浴振蕩反應(yīng) 1h,加入 p H 6.0,0.2 mol/L磷酸緩沖液2 mL終止反應(yīng),10000 r/min離心10 min后,將上清液于590 nm測(cè)定吸光度。以不加酶液的反應(yīng)系統(tǒng)為空白對(duì)照。在此條件下,水解1 mg地衣紅-彈性蛋白所需酶量定義為1個(gè)彈性蛋白酶活單位(U)。

1.2.3 彈性蛋白酶的純化

收集發(fā)酵上清液1 L,經(jīng)30%和70%飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀。離心收集沉淀,溶解于緩沖液A(0.2 mol/L硼酸緩沖液/1 mmol/L CaCl2/pH7.4),并用相同緩沖液4℃透析。經(jīng)BaCl2檢測(cè)不含硫酸銨后,酶液12000 r/min離心10 min后,取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜,將濾液轉(zhuǎn)入透析袋,用聚乙二醇-20000,4℃濃縮至8 mL。取濃縮樣品適當(dāng)稀釋后上DEAECellose柱(Amresco),用緩沖液A與0.5 mol/L NaCl做線性梯度洗脫,流速1 mL/min,收集濃縮活性峰。取樣品上Sephadex G-100柱(Phar macia),用流速為0.75 mL/min的緩沖液A洗脫,收集濃縮活性峰,備用。采用SDS-PAGE測(cè)定純化后酶蛋白質(zhì)的分子量[17]。

1.2.4 彈性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 溫度和pH對(duì)酶的影響

將酶液分別在30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃和70℃下保溫1 h,按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力,測(cè)定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液于不同溫度下處理不同時(shí)間后,在最適反應(yīng)溫度測(cè)定剩余酶活力,分析該酶的熱穩(wěn)定性[18-19]。

將酶液分別在0.2 mol/L硼砂-硼酸緩沖液(pH7.4～9.0)和0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1～8.9)中反應(yīng)1 h,測(cè)定酶的最適反應(yīng)pH。將酶液分別于pH 4.0～5.0(0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉),pH 6.0～7.0(0.2 mol/L磷酸緩沖液),pH 7.4～9.0(0.2 mol/L硼酸-硼酸鈉),pH 9.5～10.6(0.05 mol/L硼砂-氫氧化鈉),于20℃放置24 h,取出立即放置冰浴,用0.2 mol/L硼砂-硼酸緩沖液調(diào)pH到7.4,測(cè)定剩余酶活力,分析該酶的pH穩(wěn)定性[18-19]。

1.2.4.2 金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響

在酶反應(yīng)體系中加入Li+、K+、Na+、Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子和EDTA至終濃度為10 mmol/L,測(cè)定不同金屬離子和EDTA對(duì)酶活的影響[18-19],以不加金屬離子或EDTA處理的酶活為空白對(duì)照(CK)。

1.2.4.3 SDS、吐溫-80、乙醇和丙酮對(duì)酶活力的影響

在酶反應(yīng)體系中,加入SDS和吐溫-80至終濃度為0.01%、0.1%、0.5%和1%,或加入乙醇和丙酮至終濃度為2%、5%、10%和20%,按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶的相對(duì)活力,分析各試劑對(duì)酶活性的影響[18-19]。

1.2.5 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在酶反應(yīng)體系中,分別加入3 mg、6 mg、10 mg、12 mg、15 mg、18 mg、24 mg和30 mg的底物,測(cè)定其酶促反應(yīng)速度[18-19]。以底物濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo),以酶的反應(yīng)初速度的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),作Lineweaver-Bruk雙倒數(shù)圖,求出膠原蛋白酶的Vmax和Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 彈性蛋白酶的分離純化

枯草芽孢桿菌BEM01培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后,溶解透析后樣品過(guò)DEAE-Cellose柱,共有3個(gè)洗脫峰,其中第1個(gè)洗脫峰具有彈性蛋白酶活性。將活性峰洗脫液收集濃縮后過(guò)Sephadex G-100柱,共有2個(gè)洗脫峰,其中第1個(gè)洗脫峰具有彈性蛋白酶活性。將活性峰洗脫液收集濃縮,備用。彈性蛋白酶的分離純化結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,通過(guò)3步純化,最后的彈性蛋白酶樣品的純化倍數(shù)為13.79和回收率為7.88%。SDS-PAGE表明,獲得了電泳純的彈性蛋白酶,分子量約為31 ku(見(jiàn)圖1)。

表1 枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶的分離純化

圖1 彈性蛋白酶純化產(chǎn)物的SDS-PAGE

2.2 溫度對(duì)酶活性及其穩(wěn)定性的影響

在pH7.8條件下,測(cè)定各反應(yīng)溫度下的酶活,結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯?該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,當(dāng)溫度高于60℃時(shí),酶活力迅速損失超過(guò)50%,在37～50℃,酶活力可維持在65%以上。熱穩(wěn)定結(jié)果表明(圖3),酶在37℃以下保溫4 h內(nèi),酶活穩(wěn)定,損失不超過(guò)20%;在50℃保溫超過(guò)2 h,酶活損失30%左右;在60℃保溫超過(guò)1 h,酶活開(kāi)始快速下降,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),相對(duì)酶活仍穩(wěn)定在60%左右。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)彈性蛋白酶酶活性的影響

圖3 彈性蛋白酶的熱穩(wěn)定性

2.3 pH對(duì)酶活性及其穩(wěn)定性的影響

在50℃條件下,測(cè)定各反應(yīng)pH條件的酶活,結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明:在pH值7.5～9.0,該酶的最適反應(yīng)pH值與緩沖體系有關(guān)。在硼砂-硼酸緩沖體系中,酶的最適反應(yīng)pH值為7.4;而在Tris-HCl緩沖體系中,最適pH為8.6。彈性蛋白酶pH值穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明:彈性蛋白酶在pH值7.4～11.0相對(duì)穩(wěn)定,能保持在最高酶活的80%以上。當(dāng)pH<7.0時(shí),酶活力大幅度的下降,從74%迅速下降到30%。

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)酶活性的影響

圖5 酶的pH值穩(wěn)定性

2.4 金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響

考察不同金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明,在10 mmol/L濃度下,Ca2+對(duì)該彈性蛋白酶具有顯著的激活作用,相對(duì)酶活提高為對(duì)照的123.1%。Li+,K+,Na+、Mg2+、Ba2+、Mn2+和Zn2+等絕大多數(shù)金屬離子對(duì)酶活具有一定的抑制作用。而10 mmol/L的EDTA,對(duì)該彈性蛋白酶具有強(qiáng)烈的抑制作用,酶活損失超過(guò)80%?？梢?jiàn),該彈性蛋白酶為含有Ca2+的金屬蛋白酶類(lèi)。

表2 金屬離子對(duì)酶活力的影響

2.5 SDS、吐溫-80、乙醇和丙酮對(duì)酶活力的影響

表面活性劑SDS和吐溫-80,以及有機(jī)溶劑乙醇和丙酮對(duì)彈性蛋白酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。結(jié)果表明,SDS和吐溫-80對(duì)酶活有明顯的激活作用,隨著濃度的增加,酶活迅速上升;在1%濃度下,酶活分別為對(duì)照的316%和267%。低濃度的乙醇和丙酮對(duì)酶活沒(méi)有明顯影響,當(dāng)超過(guò)5%后,酶活逐漸下降;當(dāng)濃度達(dá)到20%時(shí),仍具有70%的相對(duì)酶活,表明該酶在分離純化時(shí)經(jīng)乙醇或丙酮沉淀后,殘留的微量試劑對(duì)酶活的影響有限。

圖6 表面活性劑對(duì)酶活的影響

圖7 有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響

2.6 彈性蛋白酶酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

采用Lineweaver-Burk做圖法將米氏方程化為倒數(shù)形式:

式中:V代表反應(yīng)速度,Vmax代表最大反應(yīng)速度;[S]代表底物濃度;Km代表米氏常數(shù)。通過(guò)作圖法求得直線方程為y=0.186x+32.493。從方程解得,Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057g/mL。

3 討論

本研究采用經(jīng)紫外誘變后和發(fā)酵優(yōu)化后的高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌BEM01,使得對(duì)彈性蛋白酶的分離純化更具有可操作性。在純化過(guò)程中,先后采用了硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析和分子篩層析等方法,獲得了7.88%的回收率和13.79的純化倍數(shù)。分析數(shù)據(jù)表明,該純化過(guò)程中從硫酸銨分級(jí)沉淀到離子交換層析階段,酶活損失較大,可能是由于透析硫酸銨過(guò)程和PEG20000濃縮的時(shí)間較長(zhǎng)所致。結(jié)合SDS-PAGE和分子篩層析結(jié)果,確定該彈性蛋白酶是一單鏈蛋白,分子量約為31 ku。以上結(jié)果,與陳啟和[12]、王娟麗[20]、劉宇峰[13]、Tsai[4]和Kaur[7]等報(bào)道的芽孢桿菌彈性蛋白酶分子量分別為29.5 ku、27 ku、27.8 ku、25 ku和25 ku比較接近,但其氨基酸組成是否存在差異,有待進(jìn)一步研究。

酶的穩(wěn)定性直接決定了其實(shí)用性。本研究表明,枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶的最適溫度為50℃,與目前報(bào)道的大多數(shù)該酶的最適溫度一致,僅比肖昌松等[5]報(bào)道的芽孢桿菌彈性蛋白酶最適作用溫度(55℃)略低。該酶在60℃下保持4 h后仍有60%活性,而陳啟和等[12]報(bào)道的地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在60℃下保溫60 min后酶活幾乎全部消失,劉宇峰等[13]報(bào)道彈性蛋白酶在50～60℃下保溫20 min酶全部失活,這表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。已報(bào)道的芽孢桿菌蛋白酶大多數(shù)屬于中性蛋白酶,其最適反應(yīng)pH均在7.0以上。本研究中的枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶在不同緩沖對(duì)中的最適反應(yīng)pH分別為7.4和8.6,且其堿穩(wěn)定性好,而其酸穩(wěn)定性差。這與陳啟和[12]、劉宇峰[13]報(bào)道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適反應(yīng)pH為7.4一致,與肖昌松[5]、Kaur[7]報(bào)道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適pH為9.0較接近,而與Tsai[4]報(bào)道的芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適pH為11.75不同。因此,必須嚴(yán)格控制使用該酶時(shí)的環(huán)境pH。

大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生的彈性蛋白酶屬于金屬離子蛋白酶家族。本實(shí)驗(yàn)中10 mmol/L Ca2+使酶活提高127%,表明Ca2+對(duì)彈性蛋白酶的激活有明顯的促進(jìn)和穩(wěn)定作用,EDTA則嚴(yán)重抑制該酶的活性,表明該彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類(lèi)。而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+和Mn2+對(duì)酶活均有不同程度的抑制作用。以上結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,11-13]。龔德欽等[21]認(rèn)為,溶液中存在適當(dāng)濃度的Ca2+對(duì)于維持彈性蛋白酶空間結(jié)構(gòu)、保持酶的活性及防止自溶有作用。KazuyukiMorihara[22]在研究假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶時(shí)發(fā)現(xiàn),Ca2+的存在還與彈性蛋白酶的產(chǎn)生有關(guān)。因此,在微生物發(fā)酵、彈性蛋白酶純化及保存、酶反應(yīng)中應(yīng)添加微量Ca2+非常必要。此外,SDS和吐溫-80等表面活性劑對(duì)本彈性蛋白酶具有很強(qiáng)的激活作用,在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)充分利用這一性質(zhì),使酶催化反應(yīng)達(dá)到事半功倍的效果。

枯草芽孢桿菌BEM01彈性蛋白酶屬于含有Ca2+的金屬蛋白酶類(lèi),具有良好的熱穩(wěn)定性,最適作用pH為中性或微堿性條件,適宜在肉類(lèi)嫩化中應(yīng)用。因此,枯草芽孢桿菌BEM01產(chǎn)生的彈性蛋白酶具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本課題組已克隆了該彈性蛋白酶基因,以及其高效表達(dá)載體的構(gòu)建,正在進(jìn)行基因工程菌酶的純化及其性質(zhì)研究。

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ABSTRACTThe purification of elastase was achieved by combination methods of ammonium sulfate precipitation,ionexchange chromatography and gel filtration chromatography.The elastase was purified 13.79-fold to apparent homogeneity with 7.88%overall recovery.It was a single-chain protein with a molecular mass of 31ku,and est imated by S DS-PAGE and gel filtration.Studies on enzymatic properties showed as follows:the elastase belonged to metalloproteinase containing Ca2+.The elastase activity had a temperature opt imum of 50℃alongwith good ther mal stability.Meanwhile itwasopt imal at pH 7.4 in borax-boric acid buffer or pH 8.6 in Tris-HCl,and tended stability be tween 8.0 and 11.0.10mmol/L Ca2+had stabilizing and activation on the elastase activity,whereas S DS and T ween-80 only had activation.Moreover,the elastase activitywas inhibited varying degrees bymany irons(Li+,Na+,Zn+,K+,Ba2+,Mg2+,Mn2+)and EDT A.The catalyzes dynamics equation was:y=0.186x+32.493,Vmax=0.0308 U/mL,Km=0.0057g/mL.

Key wordselastase,B acillus subtilis,purification,enzymatic properties

Purification and Characterization of Elastase fromBacillus subtilis

Liu Shu-liang1,Wu Qi2,Zhan Li1,LaiWen1
1(College of Food,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625014,China)
2(College of Life Science,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625014,China)

碩士,副教授。

＊四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(07ZA054)

2010-01-13,改回日期:2010-03-11