任賁,李莎,徐虹,蔡恒

(材料化學(xué)工程國家重點實驗室,南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,江蘇南京,210009)

蔗糖異構(gòu)酶基因在Escherichia coliBL21(DE3)中的表達(dá)及重組菌的細(xì)胞固定化＊

任賁,李莎,徐虹,蔡恒

(材料化學(xué)工程國家重點實驗室,南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,江蘇南京,210009)

分別利用IPTG和乳糖兩種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)蔗糖異構(gòu)酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中實現(xiàn)表達(dá),對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)持續(xù)時間進(jìn)行比較分析并優(yōu)化,確定了二者的最佳誘導(dǎo)條件,在E.coli培養(yǎng)3 h后(OD600約為0.9)添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG(0.5 mmol/L乳糖)在20℃(24℃)條件下誘導(dǎo)14 h(12 h)能獲得最高的蛋白表達(dá)量及SIase酶活。在最優(yōu)條件下以IPTG為誘導(dǎo)物時目的蛋白占總蛋白的41.6%,單位體積培養(yǎng)液中SIase酶活為12.37 U/mL,以乳糖為誘導(dǎo)物時分別為27.2%,14.72 U/mL,從收獲酶活角度考慮可見乳糖作為誘導(dǎo)物的優(yōu)勢;而后利用海藻酸鈉包埋法固定化重組菌,轉(zhuǎn)化初始濃度為500 g/L的蔗糖溶液,轉(zhuǎn)化10～11 h后異麥芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均轉(zhuǎn)化率大于99%,固定化細(xì)胞能夠連續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化25批次,轉(zhuǎn)化效率相對于原始菌提高了近55%。

蔗糖異構(gòu)酶(SIase),乳糖誘導(dǎo),蛋白表達(dá),IPTG,固定化

異麥芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖,Isomaltulose),是蔗糖的一種同分異構(gòu)體[1],除具有與蔗糖類似的物理性質(zhì)和口感外[2],還有低熱量、不致齲齒、不吸濕、耐酸解的特點,被廣泛地用于無糖甜食中[3],是目前最受歡迎的蔗糖替代品。

目前國內(nèi)外異麥芽酮糖的生產(chǎn)普遍采用酶轉(zhuǎn)化法,即通過微生物體內(nèi)的蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase,簡稱SIase)催化蔗糖而進(jìn)行,研究表明,沙雷氏桿菌(Serratia plym uthica)[4]、克雷伯氏桿菌(Klebsiellasp.)[5]、腸桿菌(Enterobactersp.)[6]、歐文氏桿菌(Er w iniasp.)[7]、紅色精朊桿菌(Protam inobacter rubrum)[8]都具有合成SIase的能力。利用游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖分離提取較困難,不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),大多研究者傾向于利用固定化細(xì)胞來轉(zhuǎn)化蔗糖,最近報道,Haroldo[9]等將Er w inia sp.固定化細(xì)胞應(yīng)用在填充床反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖,蔗糖轉(zhuǎn)化率為64.1%,Serratia plym uthica[10]和Protam inobacter rubrum[11]等菌株也曾被利用于固定化轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖;但大部分菌株存在細(xì)胞酶活低、酶轉(zhuǎn)化時間長、固定化細(xì)胞不穩(wěn)定的問題,因此提高生產(chǎn)菌株中蔗糖異構(gòu)酶的活力以及酶轉(zhuǎn)化時的細(xì)胞利用率顯得非常重要。

IPTG(異丙基-β-D-巰基半乳糖苷)和乳糖都具有對乳糖操縱子的誘導(dǎo)作用,前者誘導(dǎo)作用強(qiáng)烈,用量少,能夠持續(xù)穩(wěn)定誘導(dǎo),但具有潛在毒性,對菌體生長有一定抑制作用,細(xì)胞得率低[12];而后者的誘導(dǎo)過程復(fù)雜,自身又可被細(xì)胞作為碳源代謝利用,誘導(dǎo)條件不易掌握[13],但具有廉價易得,無毒無害的特點,在基因工程菌的大規(guī)模應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢。

本實驗室在前期工作中,從1株SIase高產(chǎn)菌株Er w inia rhaponticiNX-5[14]中克隆了SIase的編碼基因(palⅠ),構(gòu)建了含pET22b(+)-palⅠ表達(dá)質(zhì)粒的基因工程菌,對其進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化,研究乳糖和IPTG兩種誘導(dǎo)物對表達(dá)的影響并獲得二者的最優(yōu)表達(dá)條件。并對重組菌進(jìn)行了細(xì)胞固定化反復(fù)批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究,考察了細(xì)胞固定化后的轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性,本研究對于提高異麥芽酮糖的生產(chǎn)效率具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

含pET-22b-SIase重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3),由材料化學(xué)工程國家重點實驗室構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑與儀器

胰化蛋白胨(tryptone)和酵母提取物(yeast ex-tract),購自O(shè)XOID LTD;IPTG,購自Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS),為實驗室自制;蛋白Marker及電泳相關(guān)試劑,為Amresco公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品;牛血清蛋白和考馬斯亮藍(lán),購自NB I。海藻酸鈉為化學(xué)純,乳糖、CaCl2及其余試劑均為分析純。高效液相色譜系統(tǒng)(Dionex),Shodex R101檢測器,色譜柱Shodex SP0810(Showa Denko Co.,Ltd.,Tokyo,Japan),PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad),超聲細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-II(寧波新芝生物技術(shù)研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體生長及目的蛋白表達(dá)量的測定方法

搖瓶LB培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[15];菌體生長量以O(shè)D600值表示;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)參照文獻(xiàn)[16]。誘導(dǎo)后離心收集的菌體總蛋白經(jīng)煮沸10 min變性預(yù)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用Band Scan5.0軟件分析表達(dá)目的蛋白占總蛋白的比例。

1.2.2 SIase酶活力的測定

取經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL,8000 r/min離心5 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌1遍,用200μL磷酸鉀緩沖液(pH 5.8,0.025 mmol/L)重懸,加入800μL蔗糖溶液(500 g/L)作為底物,30℃下轉(zhuǎn)化1 h,100℃沸水浴10 min終止反應(yīng),12000 r/min離心10 min,取上清液,使用高效液相色譜測定異麥芽酮糖在產(chǎn)物中的含量,流動相為純水,流速0.3 mL/min,柱溫80℃;進(jìn)樣量20μL。以30℃條件下1 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞每分鐘催化蔗糖生成1μmol異麥芽酮糖為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

培養(yǎng)工程菌生長至穩(wěn)定期后,按照2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)3 h,分別加入乳糖至終濃度2 mmol/L和IPTG至終濃度0.5 mmol/L,分別在16℃、20℃、24℃、28℃和32℃下誘導(dǎo)表達(dá)12 h,取樣電泳后測定SIase的表達(dá)量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.4 菌株最佳誘導(dǎo)起始生長量的確定

培養(yǎng)工程菌生長至穩(wěn)定期,按照2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中,37℃分別培養(yǎng)1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h后,向培養(yǎng)液中加入乳糖至濃度達(dá)2 mmol/L,另一組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,最佳誘導(dǎo)溫度下持續(xù)誘導(dǎo)12 h,檢測SIase酶活,取樣電泳后測定SIase的表達(dá)量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.5 乳糖及IPTG最佳濃度的確定

分別向2組處于對數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液中加入不同劑量的乳糖和IPTG,使乳糖終濃度分別為0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L和3.0 mmol/L,IPTG終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L和0.8 mmol/L,最佳誘導(dǎo)溫度下持續(xù)誘導(dǎo)12 h,檢測SIase酶活,取樣電泳后測定SIase的表達(dá)量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.6 兩種誘導(dǎo)物最佳誘導(dǎo)時間的確定

分別向2組處于對數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液中加入2種誘導(dǎo)物之后,最佳誘導(dǎo)溫度下持續(xù)誘導(dǎo),在2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、14 h、16 h時測定SIase酶活和菌體生長量,并留樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 重組菌的細(xì)胞固定化靜態(tài)催化

配制2%的海藻酸鈉膠體溶液,按照25%的細(xì)胞包埋量與生理鹽水調(diào)制的菌懸液混合均勻后,加入一定濃度的細(xì)胞交聯(lián)劑,用注射器滴入3%的CaCl2溶液中固化,制成直徑約為3～4 mm的球狀固定化細(xì)胞,于4℃冰箱中靜置數(shù)小時,然后傾去上清液,經(jīng)蒸餾水洗滌2次,轉(zhuǎn)入一定濃度的蔗糖溶液直接用于反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

重組菌持續(xù)生長3 h后分別加入2種誘導(dǎo)物,在不同誘導(dǎo)溫度下持續(xù)誘導(dǎo)12 h后的蛋白表達(dá)情況見圖1,SIase酶活和菌體生長量見圖2。

圖1 兩種誘導(dǎo)物不同誘導(dǎo)溫度下表達(dá)總蛋白SDS-PAGE電泳

結(jié)果表明,2種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)在所設(shè)定的溫度梯度均能進(jìn)行,但就目的蛋白表達(dá)量和SIase酶活來說,以 IPTG作為誘導(dǎo)物時誘導(dǎo)溫度20℃能達(dá)到最大值,而以乳糖作為誘導(dǎo)物時則為24℃;雖然超過24℃后目的蛋白也會表達(dá),但酶活并不高,可能是由于溫度偏高蛋白表達(dá)過快,沒有實現(xiàn)正確折疊或形成包涵體,喪失了部分活性[17]。

圖2 兩種誘導(dǎo)物不同誘導(dǎo)溫度下的SIase酶活及細(xì)胞生長量

2.2 培養(yǎng)過程中最佳誘導(dǎo)起始點的確定

在重組菌生長不同時間添加乳糖至終濃度2 mmol/L,IPTG至終濃度0.5 mmol/L,最佳誘導(dǎo)溫度條件下誘導(dǎo)12 h后測定目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況(見圖3)和SIase酶活(圖4)。結(jié)果表明,在菌體生長的各個階段加入2種誘導(dǎo)物,均可誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),在工程菌生長2～3 h時加入誘導(dǎo)物,蛋白表達(dá)量差異不大,而選擇3 h加入誘導(dǎo)物SIase酶活可以達(dá)到最大,2種誘導(dǎo)在蛋白表達(dá)量和SIase酶活的總體趨勢大致相同,所以均選擇培養(yǎng)3 h后(OD600約為0.9)加入誘導(dǎo)物為最佳時間。

圖3 兩種誘導(dǎo)物不同誘導(dǎo)時機(jī)表達(dá)總蛋白SDS-PAGE電泳

圖4 兩種誘導(dǎo)物不同誘導(dǎo)時機(jī)的SIase酶活及細(xì)胞生長量

2.3 乳糖及IPTG最佳濃度的確定

不同劑量的乳糖和IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)和SIase酶活情況如圖7和圖8。結(jié)果顯示,濃度為0.2 mmol/L的乳糖即可誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),乳糖濃度等于或大于 1mmol/L后,即可獲得25%以上的蛋白表達(dá)量(圖5),在SIase酶活方面,乳糖濃度在0.5 mmol/L之后的差異并不明顯(圖7),而IPTG所設(shè)定的四個濃度在目的蛋白的表達(dá)量方面差異不大(圖6),均能達(dá)到40%以上,使用 0 .8 mmol/L濃度下的IPTG時SIase酶活為最大值。因此,選擇0.5 mmol/L為乳糖的最佳濃度,0.8 mmol/L為IPTG的最佳濃度。乳糖本身能夠作為碳源被細(xì)胞所用,而IPTG對于細(xì)胞有一定的毒性,所以IPTG作為誘導(dǎo)物時(圖8)細(xì)胞生長量普遍不高,因此SIase酶活只有使用乳糖作為誘導(dǎo)物時的83%,體現(xiàn)乳糖作為誘導(dǎo)物時在提高SIase酶活方面的優(yōu)勢。

圖5 不同乳糖濃度誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)

圖6 不同IPTG濃度誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)

2.4 兩種誘導(dǎo)物最佳誘導(dǎo)時間的確定

圖7 不同乳糖濃度誘導(dǎo)的SIase酶活和細(xì)胞生長量

圖8 不同IPTG濃度誘導(dǎo)的SIase酶活和細(xì)胞生長量

由圖9可以看出,以乳糖為誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)0～2 h時目的蛋白還沒有表達(dá),由于乳糖在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)作用需要一個轉(zhuǎn)運以及轉(zhuǎn)化的過程,表達(dá)時間過程具有一定的滯后[18],在誘導(dǎo)4 h時目的蛋白出現(xiàn),而后隨著誘導(dǎo)時間的延長表達(dá)量逐漸增加,在14 h時達(dá)到最大27.2%,而細(xì)胞生長量在12 h之前一直呈上升趨勢(圖11),在12 h后趨于穩(wěn)定,SIase酶活在12 h時達(dá)到最大值14.85 U/mL。以IPTG作為誘導(dǎo)物時(圖10),2 h時目的蛋白表達(dá)量即達(dá)到25.7%,6～16 h的表達(dá)量均在40%左右,16 h達(dá)到最大41.6%,但細(xì)胞生長速率低,細(xì)胞生長量在10 h之后即穩(wěn)定在2.7(OD600)左右,SIase酶活在10 h之后趨于平穩(wěn),14 h時達(dá)到最大12.37 U/mL。綜上所述,以乳糖為誘導(dǎo)物時,誘導(dǎo)時間以12 h為最佳,而IPTG以14 h為最佳。利用乳糖作為誘導(dǎo)物時SIase酶活是IPTG的約1.2倍,在收獲酶活方面具有優(yōu)勢。

圖9 乳糖誘導(dǎo)不同時間表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳

2.5 重組子與原始菌的固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化對比

分別將E.coli重組菌與原始菌制成固定化細(xì)胞(1 g細(xì)胞),轉(zhuǎn)化30 mL 500 g/L蔗糖,對比二者的轉(zhuǎn)化效率,如圖12。

圖10 IPTG誘導(dǎo)不同時間表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳

圖11 兩種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)不同時間的SIase酶活和細(xì)胞生長量

圖12 原始菌與重組菌的固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化比較

重組菌固定化細(xì)胞可以在10～11 h轉(zhuǎn)化99%以上蔗糖,異麥芽酮糖得率達(dá)到83%以上,而原始菌在19 h也只能轉(zhuǎn)化95%的蔗糖,異麥芽酮糖得率只在80%左右。同時考察了固定化重組菌細(xì)胞連續(xù)批次轉(zhuǎn)化,每一批反應(yīng)進(jìn)行11 h,取反應(yīng)液進(jìn)行測定,并加入500 g/L新鮮蔗糖溶液進(jìn)行下一批反應(yīng),結(jié)果表明固定化細(xì)胞連續(xù)使用25批次轉(zhuǎn)化率無明顯下降,異麥芽酮糖質(zhì)量濃度最高為415 g/L(異麥芽酮糖得率為83%),最低為391 g/L(異麥芽酮糖的得率為78.2%)。多批次轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物得率為297 g(異麥芽酮糖)/g(細(xì)胞)。

3 討論

本文研究了分別以乳糖和IPTG作為誘導(dǎo)物時,誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)時間等因素對菌株生長和目的蛋白表達(dá)的影響,并進(jìn)行了固定化重組菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖的研究。結(jié)果表明,2種誘導(dǎo)物在誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑量方面均有差異,乳糖的最佳誘導(dǎo)溫度為24℃,更接近室溫,因此控溫成本低,并且低劑量的乳糖即可實現(xiàn)有活性的目的蛋白的高效表達(dá),成本僅為 IPTG的0.2%左右。使用乳糖作為誘導(dǎo)物在目的蛋白表達(dá)量方面不及IPTG,只有后者的57%,并且蛋白表達(dá)時間有所滯后,但以IPTG作為誘導(dǎo)物時過快過多的蛋白表達(dá)會使菌株的生長受到額外負(fù)荷的拖累,影響菌體的收獲量進(jìn)而影響目的蛋白的產(chǎn)量以及SIase酶活,所以在最優(yōu)表達(dá)條件下,以乳糖誘導(dǎo)時的細(xì)胞量是以IPTG誘導(dǎo)時的1.36倍,SIase酶活為1.2倍。因此乳糖可作為一種T7啟動子的廉價高效誘導(dǎo)物;在利用重組菌進(jìn)行細(xì)胞固定化轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究中發(fā)現(xiàn),相同菌體量制作的固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化相同量的蔗糖,原始菌需要19 h以上,而重組菌只需10～11 h,轉(zhuǎn)化效率相對提高了近55%,多批次轉(zhuǎn)化結(jié)果說明該重組菌的細(xì)胞固定化具有持續(xù)、穩(wěn)定、高效的異麥芽酮糖生產(chǎn)能力,這為利用基因工程菌實現(xiàn)異麥芽酮糖的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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ABSTRACTThe expression of sucrose isomerase(SIase)gene in recombinantE.coliBL21(DE3)induced by lactose and IPTGwas investigated.We optimized the inducing conditions such as the culture temperature after induction,the point of induction,the inducer concentration and the induction time.The results showed that the optimal inducing conditionswere to add 0.8 mmol/L(final concentration)IPTG(0.5 mmol/L lactose)after cell growth for3h,then incubate at 20℃(24℃for lactose)for 14 h(12 h for lactose).After induction,the expression level of recombinant protein induced by lactose was about 27.2%of the total cellular protein,which was less than that induced by IPTG(41.6%).However,the SIase activity induced by lactose(14.72 U/mL)was higher than that induced by IPTG(12.37 U/mL),these results indicated the advantages of lactose as inducer in yield of SIase activity.Then sucrose with initial concentration of 500 g/L was converted to isomaltulose by the recombinantE.colicells which was immobilized using sodium-alginat,the average isomaltulose yield and conversion rate for sucrose after10～11 hwas above 83%and 99%respectively.The activity of immobilized cellswas stable after 25 batchs of conversion.The conversion efficiencywas increased by nearly 55%compared with the original strain.

Key wordssucrose isomerase(SIase),lactose induction,protein expression,IPTG,immobilization

Expression of Sucrose Isomerase inEscherichia coliBL21(DE3)and the I mmobilization of Recombinant

Ren Ben,Li Sha,Xu Hong,Cai Heng
(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Food Science and Light Industry,NanjingUniversity of Technology,Nanjing 210009,China)

碩士研究生(徐虹教授為通訊作者)。

＊國家自然科學(xué)基金項目(20906050),江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2009357),江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃項目(08KJB530004)

2010-01-26,改回日期:2010-04-27