任賁,李莎,徐虹,蔡恒

(材料化學工程國家重點實驗室,南京工業(yè)大學食品與輕工學院,江蘇南京,210009)

蔗糖異構酶基因在Escherichia coliBL21(DE3)中的表達及重組菌的細胞固定化＊

任賁,李莎,徐虹,蔡恒

(材料化學工程國家重點實驗室,南京工業(yè)大學食品與輕工學院,江蘇南京,210009)

分別利用IPTG和乳糖兩種誘導物誘導蔗糖異構酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中實現(xiàn)表達,對誘導溫度、誘導時機、誘導物濃度、誘導持續(xù)時間進行比較分析并優(yōu)化,確定了二者的最佳誘導條件,在E.coli培養(yǎng)3 h后(OD600約為0.9)添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG(0.5 mmol/L乳糖)在20℃(24℃)條件下誘導14 h(12 h)能獲得最高的蛋白表達量及SIase酶活。在最優(yōu)條件下以IPTG為誘導物時目的蛋白占總蛋白的41.6%,單位體積培養(yǎng)液中SIase酶活為12.37 U/mL,以乳糖為誘導物時分別為27.2%,14.72 U/mL,從收獲酶活角度考慮可見乳糖作為誘導物的優(yōu)勢;而后利用海藻酸鈉包埋法固定化重組菌,轉化初始濃度為500 g/L的蔗糖溶液,轉化10～11 h后異麥芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均轉化率大于99%,固定化細胞能夠連續(xù)穩(wěn)定轉化25批次,轉化效率相對于原始菌提高了近55%。

蔗糖異構酶(SIase),乳糖誘導,蛋白表達,IPTG,固定化

異麥芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖,Isomaltulose),是蔗糖的一種同分異構體[1],除具有與蔗糖類似的物理性質和口感外[2],還有低熱量、不致齲齒、不吸濕、耐酸解的特點,被廣泛地用于無糖甜食中[3],是目前最受歡迎的蔗糖替代品。

目前國內外異麥芽酮糖的生產(chǎn)普遍采用酶轉化法,即通過微生物體內的蔗糖異構酶(sucrose isomerase,簡稱SIase)催化蔗糖而進行,研究表明,沙雷氏桿菌(Serratia plym uthica)[4]、克雷伯氏桿菌(Klebsiellasp.)[5]、腸桿菌(Enterobactersp.)[6]、歐文氏桿菌(Er w iniasp.)[7]、紅色精朊桿菌(Protam inobacter rubrum)[8]都具有合成SIase的能力。利用游離細胞轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖分離提取較困難,不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),大多研究者傾向于利用固定化細胞來轉化蔗糖,最近報道,Haroldo[9]等將Er w inia sp.固定化細胞應用在填充床反應器中轉化蔗糖生成異麥芽酮糖,蔗糖轉化率為64.1%,Serratia plym uthica[10]和Protam inobacter rubrum[11]等菌株也曾被利用于固定化轉化蔗糖生成異麥芽酮糖;但大部分菌株存在細胞酶活低、酶轉化時間長、固定化細胞不穩(wěn)定的問題,因此提高生產(chǎn)菌株中蔗糖異構酶的活力以及酶轉化時的細胞利用率顯得非常重要。

IPTG(異丙基-β-D-巰基半乳糖苷)和乳糖都具有對乳糖操縱子的誘導作用,前者誘導作用強烈,用量少,能夠持續(xù)穩(wěn)定誘導,但具有潛在毒性,對菌體生長有一定抑制作用,細胞得率低[12];而后者的誘導過程復雜,自身又可被細胞作為碳源代謝利用,誘導條件不易掌握[13],但具有廉價易得,無毒無害的特點,在基因工程菌的大規(guī)模應用中具有一定的優(yōu)勢。

本實驗室在前期工作中,從1株SIase高產(chǎn)菌株Er w inia rhaponticiNX-5[14]中克隆了SIase的編碼基因(palⅠ),構建了含pET22b(+)-palⅠ表達質粒的基因工程菌,對其進行表達條件優(yōu)化,研究乳糖和IPTG兩種誘導物對表達的影響并獲得二者的最優(yōu)表達條件。并對重組菌進行了細胞固定化反復批次轉化生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究,考察了細胞固定化后的轉化效率及穩(wěn)定性,本研究對于提高異麥芽酮糖的生產(chǎn)效率具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

含pET-22b-SIase重組質粒的表達菌株E.coli BL21(DE3),由材料化學工程國家重點實驗室構建和保存。

1.1.2 試劑與儀器

胰化蛋白胨(tryptone)和酵母提取物(yeast ex-tract),購自OXOID LTD;IPTG,購自Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS),為實驗室自制;蛋白Marker及電泳相關試劑,為Amresco公司進口分裝產(chǎn)品;牛血清蛋白和考馬斯亮藍,購自NB I。海藻酸鈉為化學純,乳糖、CaCl2及其余試劑均為分析純。高效液相色譜系統(tǒng)(Dionex),Shodex R101檢測器,色譜柱Shodex SP0810(Showa Denko Co.,Ltd.,Tokyo,Japan),PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad),超聲細胞粉碎機JY92-II(寧波新芝生物技術研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體生長及目的蛋白表達量的測定方法

搖瓶LB培養(yǎng)基配方參照文獻[15];菌體生長量以OD600值表示;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)參照文獻[16]。誘導后離心收集的菌體總蛋白經(jīng)煮沸10 min變性預處理后進行SDS-PAGE電泳,采用Band Scan5.0軟件分析表達目的蛋白占總蛋白的比例。

1.2.2 SIase酶活力的測定

取經(jīng)誘導表達后的細胞培養(yǎng)液1 mL,8000 r/min離心5 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌1遍,用200μL磷酸鉀緩沖液(pH 5.8,0.025 mmol/L)重懸,加入800μL蔗糖溶液(500 g/L)作為底物,30℃下轉化1 h,100℃沸水浴10 min終止反應,12000 r/min離心10 min,取上清液,使用高效液相色譜測定異麥芽酮糖在產(chǎn)物中的含量,流動相為純水,流速0.3 mL/min,柱溫80℃;進樣量20μL。以30℃條件下1 mL培養(yǎng)液中的細胞每分鐘催化蔗糖生成1μmol異麥芽酮糖為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 最佳誘導溫度的確定

培養(yǎng)工程菌生長至穩(wěn)定期后,按照2%的接種量轉接至新鮮培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)3 h,分別加入乳糖至終濃度2 mmol/L和IPTG至終濃度0.5 mmol/L,分別在16℃、20℃、24℃、28℃和32℃下誘導表達12 h,取樣電泳后測定SIase的表達量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.4 菌株最佳誘導起始生長量的確定

培養(yǎng)工程菌生長至穩(wěn)定期,按照2%的接種量轉接至新鮮培養(yǎng)基中,37℃分別培養(yǎng)1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h后,向培養(yǎng)液中加入乳糖至濃度達2 mmol/L,另一組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,最佳誘導溫度下持續(xù)誘導12 h,檢測SIase酶活,取樣電泳后測定SIase的表達量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.5 乳糖及IPTG最佳濃度的確定

分別向2組處于對數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液中加入不同劑量的乳糖和IPTG,使乳糖終濃度分別為0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L和3.0 mmol/L,IPTG終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L和0.8 mmol/L,最佳誘導溫度下持續(xù)誘導12 h,檢測SIase酶活,取樣電泳后測定SIase的表達量,并檢測最終菌體生長量。

1.2.6 兩種誘導物最佳誘導時間的確定

分別向2組處于對數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液中加入2種誘導物之后,最佳誘導溫度下持續(xù)誘導,在2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、14 h、16 h時測定SIase酶活和菌體生長量,并留樣進行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 重組菌的細胞固定化靜態(tài)催化

配制2%的海藻酸鈉膠體溶液,按照25%的細胞包埋量與生理鹽水調制的菌懸液混合均勻后,加入一定濃度的細胞交聯(lián)劑,用注射器滴入3%的CaCl2溶液中固化,制成直徑約為3～4 mm的球狀固定化細胞,于4℃冰箱中靜置數(shù)小時,然后傾去上清液,經(jīng)蒸餾水洗滌2次,轉入一定濃度的蔗糖溶液直接用于反應。

2 結果與討論

2.1 最佳誘導溫度的確定

重組菌持續(xù)生長3 h后分別加入2種誘導物,在不同誘導溫度下持續(xù)誘導12 h后的蛋白表達情況見圖1,SIase酶活和菌體生長量見圖2。

圖1 兩種誘導物不同誘導溫度下表達總蛋白SDS-PAGE電泳

結果表明,2種誘導物誘導重組蛋白的表達在所設定的溫度梯度均能進行,但就目的蛋白表達量和SIase酶活來說,以 IPTG作為誘導物時誘導溫度20℃能達到最大值,而以乳糖作為誘導物時則為24℃;雖然超過24℃后目的蛋白也會表達,但酶活并不高,可能是由于溫度偏高蛋白表達過快,沒有實現(xiàn)正確折疊或形成包涵體,喪失了部分活性[17]。

圖2 兩種誘導物不同誘導溫度下的SIase酶活及細胞生長量

2.2 培養(yǎng)過程中最佳誘導起始點的確定

在重組菌生長不同時間添加乳糖至終濃度2 mmol/L,IPTG至終濃度0.5 mmol/L,最佳誘導溫度條件下誘導12 h后測定目標蛋白的表達情況(見圖3)和SIase酶活(圖4)。結果表明,在菌體生長的各個階段加入2種誘導物,均可誘導目的蛋白的表達,在工程菌生長2～3 h時加入誘導物,蛋白表達量差異不大,而選擇3 h加入誘導物SIase酶活可以達到最大,2種誘導在蛋白表達量和SIase酶活的總體趨勢大致相同,所以均選擇培養(yǎng)3 h后(OD600約為0.9)加入誘導物為最佳時間。

圖3 兩種誘導物不同誘導時機表達總蛋白SDS-PAGE電泳

圖4 兩種誘導物不同誘導時機的SIase酶活及細胞生長量

2.3 乳糖及IPTG最佳濃度的確定

不同劑量的乳糖和IPTG誘導目的蛋白的表達和SIase酶活情況如圖7和圖8。結果顯示,濃度為0.2 mmol/L的乳糖即可誘導目的蛋白的表達,乳糖濃度等于或大于 1mmol/L后,即可獲得25%以上的蛋白表達量(圖5),在SIase酶活方面,乳糖濃度在0.5 mmol/L之后的差異并不明顯(圖7),而IPTG所設定的四個濃度在目的蛋白的表達量方面差異不大(圖6),均能達到40%以上,使用 0 .8 mmol/L濃度下的IPTG時SIase酶活為最大值。因此,選擇0.5 mmol/L為乳糖的最佳濃度,0.8 mmol/L為IPTG的最佳濃度。乳糖本身能夠作為碳源被細胞所用,而IPTG對于細胞有一定的毒性,所以IPTG作為誘導物時(圖8)細胞生長量普遍不高,因此SIase酶活只有使用乳糖作為誘導物時的83%,體現(xiàn)乳糖作為誘導物時在提高SIase酶活方面的優(yōu)勢。

圖5 不同乳糖濃度誘導的蛋白表達

圖6 不同IPTG濃度誘導的蛋白表達

2.4 兩種誘導物最佳誘導時間的確定

圖7 不同乳糖濃度誘導的SIase酶活和細胞生長量

圖8 不同IPTG濃度誘導的SIase酶活和細胞生長量

由圖9可以看出,以乳糖為誘導劑在誘導0～2 h時目的蛋白還沒有表達,由于乳糖在細胞內發(fā)揮誘導作用需要一個轉運以及轉化的過程,表達時間過程具有一定的滯后[18],在誘導4 h時目的蛋白出現(xiàn),而后隨著誘導時間的延長表達量逐漸增加,在14 h時達到最大27.2%,而細胞生長量在12 h之前一直呈上升趨勢(圖11),在12 h后趨于穩(wěn)定,SIase酶活在12 h時達到最大值14.85 U/mL。以IPTG作為誘導物時(圖10),2 h時目的蛋白表達量即達到25.7%,6～16 h的表達量均在40%左右,16 h達到最大41.6%,但細胞生長速率低,細胞生長量在10 h之后即穩(wěn)定在2.7(OD600)左右,SIase酶活在10 h之后趨于平穩(wěn),14 h時達到最大12.37 U/mL。綜上所述,以乳糖為誘導物時,誘導時間以12 h為最佳,而IPTG以14 h為最佳。利用乳糖作為誘導物時SIase酶活是IPTG的約1.2倍,在收獲酶活方面具有優(yōu)勢。

圖9 乳糖誘導不同時間表達蛋白的SDS-PAGE電泳

2.5 重組子與原始菌的固定化細胞轉化對比

分別將E.coli重組菌與原始菌制成固定化細胞(1 g細胞),轉化30 mL 500 g/L蔗糖,對比二者的轉化效率,如圖12。

圖10 IPTG誘導不同時間表達蛋白的SDS-PAGE電泳

圖11 兩種誘導物誘導不同時間的SIase酶活和細胞生長量

圖12 原始菌與重組菌的固定化細胞轉化比較

重組菌固定化細胞可以在10～11 h轉化99%以上蔗糖,異麥芽酮糖得率達到83%以上,而原始菌在19 h也只能轉化95%的蔗糖,異麥芽酮糖得率只在80%左右。同時考察了固定化重組菌細胞連續(xù)批次轉化,每一批反應進行11 h,取反應液進行測定,并加入500 g/L新鮮蔗糖溶液進行下一批反應,結果表明固定化細胞連續(xù)使用25批次轉化率無明顯下降,異麥芽酮糖質量濃度最高為415 g/L(異麥芽酮糖得率為83%),最低為391 g/L(異麥芽酮糖的得率為78.2%)。多批次轉化后的產(chǎn)物得率為297 g(異麥芽酮糖)/g(細胞)。

3 討論

本文研究了分別以乳糖和IPTG作為誘導物時,誘導溫度、誘導物濃度、誘導時機、誘導時間等因素對菌株生長和目的蛋白表達的影響,并進行了固定化重組菌細胞轉化蔗糖生成異麥芽酮糖的研究。結果表明,2種誘導物在誘導溫度、誘導時間、誘導劑量方面均有差異,乳糖的最佳誘導溫度為24℃,更接近室溫,因此控溫成本低,并且低劑量的乳糖即可實現(xiàn)有活性的目的蛋白的高效表達,成本僅為 IPTG的0.2%左右。使用乳糖作為誘導物在目的蛋白表達量方面不及IPTG,只有后者的57%,并且蛋白表達時間有所滯后,但以IPTG作為誘導物時過快過多的蛋白表達會使菌株的生長受到額外負荷的拖累,影響菌體的收獲量進而影響目的蛋白的產(chǎn)量以及SIase酶活,所以在最優(yōu)表達條件下,以乳糖誘導時的細胞量是以IPTG誘導時的1.36倍,SIase酶活為1.2倍。因此乳糖可作為一種T7啟動子的廉價高效誘導物;在利用重組菌進行細胞固定化轉化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究中發(fā)現(xiàn),相同菌體量制作的固定化細胞轉化相同量的蔗糖,原始菌需要19 h以上,而重組菌只需10～11 h,轉化效率相對提高了近55%,多批次轉化結果說明該重組菌的細胞固定化具有持續(xù)、穩(wěn)定、高效的異麥芽酮糖生產(chǎn)能力,這為利用基因工程菌實現(xiàn)異麥芽酮糖的生產(chǎn)奠定了基礎。

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ABSTRACTThe expression of sucrose isomerase(SIase)gene in recombinantE.coliBL21(DE3)induced by lactose and IPTGwas investigated.We optimized the inducing conditions such as the culture temperature after induction,the point of induction,the inducer concentration and the induction time.The results showed that the optimal inducing conditionswere to add 0.8 mmol/L(final concentration)IPTG(0.5 mmol/L lactose)after cell growth for3h,then incubate at 20℃(24℃for lactose)for 14 h(12 h for lactose).After induction,the expression level of recombinant protein induced by lactose was about 27.2%of the total cellular protein,which was less than that induced by IPTG(41.6%).However,the SIase activity induced by lactose(14.72 U/mL)was higher than that induced by IPTG(12.37 U/mL),these results indicated the advantages of lactose as inducer in yield of SIase activity.Then sucrose with initial concentration of 500 g/L was converted to isomaltulose by the recombinantE.colicells which was immobilized using sodium-alginat,the average isomaltulose yield and conversion rate for sucrose after10～11 hwas above 83%and 99%respectively.The activity of immobilized cellswas stable after 25 batchs of conversion.The conversion efficiencywas increased by nearly 55%compared with the original strain.

Key wordssucrose isomerase(SIase),lactose induction,protein expression,IPTG,immobilization

Expression of Sucrose Isomerase inEscherichia coliBL21(DE3)and the I mmobilization of Recombinant

Ren Ben,Li Sha,Xu Hong,Cai Heng
(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Food Science and Light Industry,NanjingUniversity of Technology,Nanjing 210009,China)

碩士研究生(徐虹教授為通訊作者)。

＊國家自然科學基金項目(20906050),江蘇省自然科學基金項目(BK2009357),江蘇省高校自然科學研究計劃項目(08KJB530004)

2010-01-26,改回日期:2010-04-27