張建友，姜艷喜，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州，310014)

加鹽量對固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的影響及其動力學研究*

張建友，姜艷喜，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州，310014)

采用控溫、加曲、低鹽殺菌工藝結合固態(tài)發(fā)酵技術對魷魚廢棄物進行再加工利用，以減少環(huán)境污染并高效利用蛋白資源。綜合考慮固態(tài)發(fā)酵過程中的蛋白酶活力、氨基態(tài)氮含量、總酸含量、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量等指標來研究最佳的發(fā)酵工藝。結果表明，8 g/100 g(原料)加鹽量下，氨基氮、TCA可溶性氮(TCA-N)、總可溶性氮(TSN)較高，TVB-N含量較低，丙二醛含量(TBARS值)較低，確定8 g/100 g(原料)加鹽量為最適宜的發(fā)酵加鹽量。同時采用ORIGIN7.5軟件得到了氨基氮生成動力學模型，在一定程度上揭示了發(fā)酵的基本特征，用來預測發(fā)酵液中氨基氮濃度。

米曲霉，加鹽量，魷魚廢棄物，固態(tài)發(fā)酵

魷魚加工中大約會產生魷魚本身體重50%的廢棄物，這些廢棄物的隨意處置可能會導致資源浪費以及環(huán)境污染等問題[1］。近年來，伴隨著我國魷釣業(yè)以及沿海地區(qū)魷魚加工業(yè)的快速發(fā)展，如何利用這些廢棄物已經成了當務之急[2］。筆者探討了利用米曲霉發(fā)酵魷魚廢棄物產風味前體物質的工藝技術路線，為今后魷魚廢棄物再利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉3042、豆粕、麩皮，杭州市食品釀造有限公司。

魷魚廢棄物，中國水產舟山海洋漁業(yè)有限公司，實驗室貯藏于-20℃冰柜中。

1.2 實驗儀器

CR21GⅡ高速冷凍離心機，日本日立公司;752N紫外可見分光光度計、PHS-3CpH計，上海精科實業(yè)有限公司;450Watt食品調理機4162，德國博朗有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;98-Ⅱ型強磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺;BSP-250生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 米曲霉3042的活化培養(yǎng)

以無菌操作方式，將4℃冰箱保藏菌種米曲霉3042轉接于試管豆汁斜面培養(yǎng)基上，30℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)96 h(根據生長情況以及菌種的保藏時間可以選擇進行2代或者3代活化培養(yǎng))。

1.3.2 米曲霉3042的擴大培養(yǎng)

以無菌操作方式，將活化好的菌種轉接于茄子瓶豆汁斜面培養(yǎng)基上，30℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)96 h。

1.3.3 制種曲

采用100 mL三角瓶培養(yǎng)m(豆粕)∶m(鼓皮)=1∶3，水分含量52%，121℃滅菌30 min)，將擴大培養(yǎng)的米曲霉制成孢子懸浮液，按一定量(1 mL菌懸液/10 g固體培養(yǎng)基)接入種曲三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，其間手動搖瓶2次。

1.3.4 米曲霉3042固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物

米曲霉3042固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的工藝流程見圖1。主要控制點:分裝100 mL漿液于500 mL三角瓶中;105℃濕熱滅菌40 min;30℃搖床靜置發(fā)酵(每隔12 h搖瓶翻曲)。

圖1 米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物工藝流程

1.4 分析方法

蛋白酶酶活力的測定:福林酚法[3］;氨基態(tài)氮:甲醛滴定法(GB 5009.39-851996);揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N):半微量擴散法[4］;總酸含量的測定:電位滴定法(GB/T 12456-901991);總可溶性氮(TSN)含量測定:凱氏定氮法[5］;TCA可溶性氮(TCA-N)含量測定;游離脂肪酸含量以及酸價的測定:KOH標準滴定液滴定法[7］;pH值測定:酸度計;脂肪氧化丙二醛含量(TBARS值)的測定:見文獻[8］。

2 結果與討論

2.1 加鹽量對米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物理化指標的影響

2.1.1 對發(fā)酵過程中蛋白酶活力的影響

米曲霉固態(tài)發(fā)酵魷魚廢棄物的過程中主要產生氨基酸和短肽，其中有一部分是呈味氨基酸，使得發(fā)酵液具有獨特的風味。而這些氨基酸和短肽的產生則主要由于種曲和發(fā)酵過程中米曲霉產生的蛋白酶水解魷魚廢棄物蛋白質所得，但是食鹽卻對蛋白酶酶活力的大小具有顯著的影響作用[9］。食鹽對酶活力的影響通常因酶種類及食鹽濃度不同而有差異，一般情況下，高鹽會明顯抑制蛋白酶活力。

在食品工業(yè)生產中，中性蛋白酶很重要，因為中性蛋白酶能將蛋白質水解成氨基酸、多肽等，并可減少蛋白水解苦味物質產生[10］。鑒于發(fā)酵初始環(huán)境pH值是弱酸性，并且整個發(fā)酵過程中的pH值基本都在弱酸性的條件下，所以同時研究了發(fā)酵過程中酸性蛋白酶的活力變化。

圖2、圖3、圖4揭示了發(fā)酵過程中蛋白酶酶活力的變化趨勢，可以看出:(1)在不同的加鹽量下初始的酶活力不相同，隨著鹽濃度的升高，蛋白酶酶活力明顯降低，這與Sappasith Klomklao等[11］的研究現象相同，加鹽量16g/100g(原料)的各種酶的酶活力明顯受到了抑制，這可能是因為高鹽作用下，NaCl的高滲透壓作用使蛋白酶分子的結構不穩(wěn)定，降低蛋白酶的生理活性，使酶活下降;另外，也可能是因為蛋白酶發(fā)生鹽析變性，降低了酶活[12-13］。(2)在不同的加鹽量下，隨著發(fā)酵時間的增加，各種酶的酶活力都是逐漸升高的，發(fā)酵到第6天后各種酶的酶活力增加變緩逐漸趨于平穩(wěn)，有的甚至開始下降，這可能是蛋白酶的自溶分解以及代謝產物氨基酸、多肽等的抑制作用[14］所致。

2.1.2 對發(fā)酵過程中氨基氮、TCA-N、TSN的影響

發(fā)酵過程中產生的氨基酸和短肽主要是微生物源蛋白酶水解作用的效果，這是由于發(fā)酵之前的滅菌過程已經使內源性蛋白酶失活。因此發(fā)酵過程中產生的氨基氮含量的高低是評價發(fā)酵質量的重要指標，可以用于表征蛋白質的水解程度[15-17］。TCA-N含量變化是衡量生物活性肽含量的重要指標，這對研究魷魚內臟中生物活性物質具有重要的意義;TSN同樣是衡量發(fā)酵過程氮含量變化的重要指標，結合氨基氮含量用來表征蛋白質的變化。因此考察了發(fā)酵過程中氨基氮、TCA-N、TSN的變化情況。

圖2 加鹽量對發(fā)酵過程中酸性蛋白酶的影響

圖3 加鹽量對發(fā)酵過程中中性蛋白酶的影響

圖4 加鹽量對發(fā)酵過程中堿性蛋白酶的影響

圖5 加鹽量對發(fā)酵過程中氨基氮含量的影響

圖6 加鹽量對發(fā)酵過程中TCA-N含量的影響

圖7 加鹽量對發(fā)酵過程中TSN含量的影響

從圖5-圖7可見，不同加鹽量下氨基氮，TCAN，TSN隨時間的變化趨勢與蛋白酶酶活力的變化規(guī)律基本一致，都在第6天后開始變化緩慢。4、8、12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量第10天分別達到0.725、0.671、0.626 g/100 mL 和0.502 g/100 mL。其氨基態(tài)氮含量隨加鹽量的遞增呈遞減趨勢，可能是因為高鹽使蛋白質脫水并中和其電荷，而從溶液中沉淀出來，使蛋白質凝聚變性，降低了酶活，從而降低水解率，導致水解度降低，氨基酸含量減少[18］;另一方面，最終產物如氨基酸、多肽的存在也抑制了一部分酶活，從而降低了水解度[14］;同時高鹽對于發(fā)酵液中的蛋白質也有類似作用，使蛋白質發(fā)生鹽析變性，沉淀出來，使蛋白質含量下降，導致水解得到的氨基態(tài)氮也減少。

不同加鹽量下TCA-N和TSN的初始含量不同，這是由于在不同的鹽濃度下它們的溶解度不同導致初始含量不同。但它們的總體變化趨勢與氨基氮的變化趨勢相同，這可能是由于原料蛋白質不斷被蛋白酶水解變成可溶性的肽類及氨基酸成分，其實主要源于較高的蛋白酶活力以及均質加工增加了酶作用面積[19］。TSN包括氨基氮和一些可溶性的蛋白氮，由圖6，圖7我們發(fā)現12g/100g(原料)的加鹽量下，在發(fā)酵的第4天其TSN和TCA-N含量超越了其他3種加鹽量的發(fā)酵工藝，這可能與發(fā)酵環(huán)境的離子強度有關系，使得12g/100g(原料)的TSN和TCA-N的含量增加[20］。

2.1.3 對發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的影響

由圖8可以看出整個發(fā)酵過程中pH值的變化不甚明顯，高鹽濃度的pH值低于低鹽濃度的pH值。這也與蛋白酶活力大小以及氨基氮的溶出率有關。有機酸是發(fā)酵液的主要風味物質，發(fā)酵過程中總酸含量的變化反映產酸微生物的變化情況，是發(fā)酵過程控制的要素之一。由圖9可知，各加鹽量處理下的總酸變化隨著時間的延長呈現先增后降的鐘形變化趨勢，發(fā)酵10 d后8 g/100 g(原料)加鹽量下的總酸含量最低，12 g/100 g原料加鹽量下的總酸最高。8 g/100 g(原料)鹽度下發(fā)酵液最后的pH值為5.77，12 g/100 g(原料)鹽度下的pH值為5.10。表明發(fā)酵前期，微生物生長產酸、產酶，pH值降低，酸度增加，后期隨著酶的水解，氨基酸增加，pH值增加，酸度降低。特別是低鹽下，腐敗菌產生揮發(fā)性氨類物質，使得酸度急劇下降。綜上總酸呈現這種變化趨勢可能是發(fā)酵過程中微生物產酸量和產生的堿性揮發(fā)性鹽基氮成分相互作用的結果[9］。

圖8 加鹽量對發(fā)酵過程中pH值的影響

圖9 加鹽量對發(fā)酵過程中總酸含量的影響

2.1.4 對發(fā)酵過程腐敗情況的影響

在魷魚廢棄物發(fā)酵過程中加鹽是為了抑制腐敗菌的生長，防止發(fā)酵液腐敗變質。低鹽會使腐敗菌生長，產生各種揮發(fā)性氨類等物質影響發(fā)酵產品品質;高鹽雖可抑制腐敗菌生長，但同時會抑制米曲霉的生長，延長發(fā)酵時間。在食品加工業(yè)中，通常采用TVBN值來檢測水產品的腐敗程度[21］。

由圖10知，整個發(fā)酵過程中，TVB-N的含量呈上升趨勢，4、8 g/100 g(原料)的加鹽濃度下，發(fā)酵后期的增加速度逐漸加快，4 g/100 g(原料)下表現最為明顯。12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵后期，TVB-N含量趨于平穩(wěn)。發(fā)酵10 d后，4、8、12、16 g/100 g(原料)的加鹽量下 T VB-N值分別為223.0，162.1，122.6，98.1 mg/100 mL。4 g/100 g(原料)加鹽量下的TVB-N值比其他3個加鹽量下的值明顯高出很多，這可能與體系中的水分活度有關，一般細菌的生長最低aW為9.4，所以在高鹽濃度下發(fā)酵液中腐敗細菌被抑制，從而降低了揮發(fā)性鹽基氮的產生[22］。4 g/100 g(原料)的加鹽量下發(fā)酵結束時發(fā)酵液的感觀評定表明它的風味明顯遜于其他3種加鹽量下的產物風味，所以在后續(xù)的發(fā)酵中建議不選擇此加鹽量。

圖10 加鹽量對發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

2.1.4 對發(fā)酵過程中脂肪的影響

魚類的脂肪中富含大量的不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸極易被氧化產生哈喇味，除此之外還會影響到質構、色澤和營養(yǎng)價值[23］。經檢測魷魚廢棄物中的脂肪含量為1.7%左右，所以考察發(fā)酵過程中脂肪氧化的變化顯得頗為重要。

圖11 加鹽量對脂肪的TBARS值的影響

脂肪氧化的終產物之一為丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸(TBA)在一定條件下反應產生紅色物質(TBARS)，并在532 nm下有最大吸收峰，因此TBARS值的大小可用來表示脂肪受氧化的程度[24］。目前的科學研究中，也多用TBARS值來表征脂肪的氧化程度，因此實驗考察了TBARS值的變化趨勢。

由圖11可以看出，魷魚加工廢棄物在發(fā)酵過程中TBARS值的變化趨勢:①高鹽濃度下TBARS值在第2～4天有個明顯的下降趨勢，低鹽濃度下，在第4～6天有明顯的下降趨勢，這可能與不同鹽濃度下蛋白質的溶出程度有關，因為丙二醛可以與蛋白質發(fā)生交聯(lián)反應，使丙二醛呈結合狀態(tài)而不被檢測出來;②在整個發(fā)酵過程中，高鹽濃度下，TBARS值呈現明顯的上升趨勢，低鹽濃度下，TBARS值變化緩慢，發(fā)酵后期趨于平穩(wěn)。Sikorski等研究表明，魚類保持高品質所允許的TBARS值的最大值為5 mg/kg即5 μg/g[25］。發(fā)酵結束后，4、8、12、16 g/100g(原料)的加鹽量下 的TBARS值分別 為4.723、4.375、7.317和7.8855μg/g，高鹽濃度下發(fā)酵結束時的TBARS值超過了人的感官所能承受的范圍，所以建議發(fā)酵生產中不選擇此發(fā)酵條件。

圖12 加鹽量對游離脂肪酸含量的影響

圖13 加鹽量對酸價的影響

由圖12，圖13可以看出發(fā)酵過程中的游離脂肪酸含量和酸價的變化趨勢:(1)均保持上升趨勢，這與Tatterson和Windsord的研究結果相同[26］，這可能是因為脂肪在酶的作用下水解出脂肪酸以及脂肪氧化過程中產生了一些低分子的脂肪酸;(2)發(fā)酵后期它們的上升趨勢變得明顯，這說明游離脂肪酸在不斷的積累，酸價的變化趨勢也反映出了魷魚廢棄物的發(fā)酵過程漸近完全。

綜上實驗結果表明，8 g/100 g(原料)鹽度下的氨基氮較高，而TVB-N較低，TBARS值較低，所以確定8 g/100 g(原料)鹽度為最適宜的發(fā)酵的加鹽量。

2.2 發(fā)酵動力學研究

為了揭示發(fā)酵過程的基本特征，預測發(fā)酵液中氨基酸含量，判知蛋白質的水解程度，從而判斷發(fā)酵過程的完全與否，在確定加鹽量的基礎上，依據圖5米曲霉發(fā)酵產氨基氮曲線，采用Oringin7.5軟件對米曲霉的氨基酸生成進行非線性曲線擬合。依據發(fā)酵特點采用曲線估計模型對氨基酸生成進行多項式擬合，擬合曲線如圖14所示。

圖14 不同NaCl添加量下的二項式擬合氨基酸生成量

表1 不同鹽度氨基酸生成模型參數

表1可以看出不同加鹽量下的擬合方程R2＞0.970，P＜0.05影響顯著，擬合程度高。適應4～16 g/100 g(原料)的加鹽范圍內的動力學模型如下:

假設動力學方程為Y=AT2+BT+C(Y:氨基氮濃度，A、B、C:模型參數，T:發(fā)酵時間)則A，B，C對加鹽量x(4～16g/100g(原料))的多項式擬合方程為[27-28］:

由方程知，A，B，C對加鹽量x的擬合方程R2＞0.9980，擬合精度高。

綜上發(fā)酵溫度控制30℃，不添加任何外源性蛋白酶，加鹽量在4～16 g/100 g(原料)的區(qū)間內，氨基氮含量對發(fā)酵時間的擬合方程能夠很好的反映發(fā)酵過程的變化，從而指導實際的企業(yè)生產。

3 結論

本實驗采用控溫、加曲，低鹽殺菌等發(fā)酵方法進行魷魚廢棄物的固態(tài)發(fā)酵。綜合考慮發(fā)酵過程中蛋白酶活、氨基酸態(tài)氮、總酸、TVB-N等指標，發(fā)現8 g/100 g(原料)鹽度下氨基氮較高，TVB-N值較低，TBARS較低，確定8 g/100 g(原料)鹽度為最適宜的發(fā)酵的加鹽量。同時用ORIGIN7.5軟件對實驗數據進行處理計算，得到了氨基酸生成動力學模型，在一定程度上揭示了發(fā)酵的基本特征，可以用來預測發(fā)酵液中氨基酸濃度，判斷發(fā)酵過程的正常與否，從而對發(fā)酵操作參數提出要求，以便加以控制，指導實際生產，實現發(fā)酵過程的優(yōu)化，為今后的工業(yè)化生產提供依據。

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ABSTRACTThe study used solid-state fermentation technology with controlled temperature，koji，and low-salt sterilization to re-process squid wastes in order to reduce environmental pollution and use protein resources effectively.During the solid-state fermentation，protease activity，amino nitrogen content，total acid content，volatile basic nitrogen(TVB-N)content and so on were determined，to study the optimal fermentation process.The result shows that adding the amino nitrogen to 8g/100g raw material was the optimal fermentation process，and the TCA soluble nitrogen(TCA-N)，total soluble nitrogen(TSN)were higher，while TVB-N content and malondialdehyde content(TBARS values)were lower.We also used ORIGIN7.5 software to calculate the experimental data and obtained the dynamics model of producing amino acid nitrogen.

Key wordsaspergillus oryzae，salinity，squid wastes，solid-state fermentation

Study Salinity on Solid-state Fermentation of Squid Wastes and Its Kinetics

Zhang Jian-you，Jiang Yan-xi，Ding Yu-ting
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University ofTechnology，Hangzhou 310014，China)

博士研究生(丁玉庭教授為通訊作者)。

*浙江省科技廳科研社會發(fā)展項目“魷魚加工副產物的高值化開發(fā)利用與產業(yè)化”(2008C23021)

2010-01-21，改回日期:2010-03-29