許云賀，蘇玉虹，劉顯軍，李寶龍，邊連全，*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110161;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001;3.綿陽(yáng)新一美化工有限公司，四川成都610500)

微量元素鉻對(duì)豬肉質(zhì)性狀的影響

許云賀1，2，蘇玉虹2，劉顯軍1，李寶龍3，邊連全1，*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110161;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001;3.綿陽(yáng)新一美化工有限公司，四川成都610500)

將18頭70kg左右的杜長(zhǎng)大三元雜交豬隨機(jī)分為2個(gè)處理組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧和實(shí)驗(yàn)日糧，實(shí)驗(yàn)日糧為基礎(chǔ)日糧中添加吡啶羧酸鉻，鉻在日糧中的添加濃度為200μg/kg。研究鉻對(duì)肥育豬肉質(zhì)性狀的影響。結(jié)果表明:在豬肥育期日糧中添加鉻，可以顯著提高眼肌面積(LMA)、宰后24h肌肉pH和肌內(nèi)脂肪(IMF)含量(P＜0.05)，減少滴水損失和血清游離脂肪酸(NEFA)含量(P＜0.05)。通過(guò)對(duì)H－FABP基因表達(dá)量的分析表明，鉻顯著提高了肌肉組織中H－FABP基因表達(dá)量(P＜0.05)，H－FABP基因表達(dá)量與IMF含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.826(P=0.042);與NEFA含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.753(P=0.046)。研究表明，鉻能夠顯著提高肌肉組織中H－FABP基因表達(dá)量，減少血清NEFA含量，改善肉質(zhì)性狀。

豬，鉻，心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H－FABP)基因，基因表達(dá)，肉質(zhì)

Abstract:18 DLY pigs(70kg)were randomly divided into two dietary treatments without or with 200μg/kg of Cr from chromium picolinate.The experiment was conducted to determine the effect of dietary Cr on pork quality in finishing swine.The results showed that dietary Cr addition increased longissimus muscle area(LMA)，twenty－four－h(huán)our loin pH and intramuscular fat(IMF)content(P ＜0.05)，decreased drip loss and non－esterified fatty acids(NEFA)content(P＜0.05).Dietary Cr addition increased H－FABP gene expression level(P＜0.05).H－FABP gene expression level was positively related to IMF content(r=0.826，P=0.042)，negatively related to NEFA content(r=－0.753，P=0.046).These results suggested that dietary Cr addition might increase H－FABP gene expression level，decrease NEFA content and improve meat quality.

Key words:pigs;Chromium(Cr);heart－type fatty acid binding proteins(H－FABP)gene;gene expression;meat quality

肉質(zhì)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的數(shù)量性狀，豬的品種直接影響肉質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)是影響肉質(zhì)的另一重要因素。近年來(lái)，許多學(xué)者正在研究通過(guò)營(yíng)養(yǎng)學(xué)途徑來(lái)調(diào)控豬生長(zhǎng)以達(dá)到改善胴體品質(zhì)和肉質(zhì)的目的。營(yíng)養(yǎng)素雖然不能改變動(dòng)物體的遺傳性狀，但可以調(diào)控?cái)?shù)量性狀基因的表達(dá)而改變?cè)撔誀睿?］。鉻是人和動(dòng)物的必需微量元素，近十幾年來(lái)對(duì)鉻在豬的營(yíng)養(yǎng)上進(jìn)行了許多研究，結(jié)果表明，鉻對(duì)豬的肉質(zhì)具有一定的影響。但是，在前人的研究中鉻對(duì)肉質(zhì)的影響研究結(jié)果不一。Page［2］報(bào)道鉻提高了胴體瘦肉率，但Evock［3］報(bào)道鉻對(duì)胴體瘦肉率無(wú)影響。Boleman［4］研究發(fā)現(xiàn)，鉻僅在肥育期改善胴體組成，對(duì)豬肉剪切力、系水力無(wú)影響。O’Quinn［5］報(bào)道添加吡啶羧酸鉻降低了大理石花紋得分和滴水損失。Matthew［6］和Shelton［7］報(bào)道表明鉻提高了肌肉大理石花紋得分和系水力。隨著人們對(duì)肉質(zhì)的重視，飼料中鉻的添加，鉻對(duì)肉質(zhì)的影響需要進(jìn)一步研究。豬H－FABP基因是近年發(fā)現(xiàn)的影響豬肉質(zhì)的候選主效基因［8－9］。HFABP是一種低分子量胞漿蛋白，主要分布在心肌、骨骼肌和脂肪細(xì)胞中［10］，H－FABP在細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進(jìn)細(xì)胞攝取脂肪酸［11］。豬H－FABP基因在mRNA表達(dá)水平對(duì)肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)含量影響顯著［12］。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)，結(jié)合鉻對(duì)基因表達(dá)量的影響，研究鉻對(duì)肉質(zhì)性狀的影響，為從分子水平改善肉質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇70kg左右的杜長(zhǎng)大三元雜交豬18頭，隨機(jī)分為2個(gè)處理組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬。1組飼喂基礎(chǔ)日糧，2組飼喂實(shí)驗(yàn)日糧。至體重達(dá)到100kg左右時(shí)屠宰。基礎(chǔ)日糧參照中國(guó)瘦肉型豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(GB8471－87)配制，確定消化能(DE)為 12.55MJ/kg、粗蛋白質(zhì)(CP)為14.0%;實(shí)驗(yàn)日糧為基礎(chǔ)日糧中添加吡啶羧酸鉻(綿陽(yáng)新一美化工有限公司)，鉻在日糧中的添加濃度為200μg/kg。

1.2 樣本采集及測(cè)定指標(biāo)

豬屠宰后，采集血液，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?，測(cè)定血清甘油三酯和NEFA濃度;肉樣采集位置為個(gè)體的最后肋骨和最后腰椎間單側(cè)背最長(zhǎng)肌(帶有皮和背膘)，采集量為700g/個(gè)體左右。其中一部分樣本立即置于液氮中速凍后，－70℃保存，用于提取肌肉組織總RNA。血清甘油三酯濃度、血清NEFA濃度、肌肉組織蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和脂蛋白脂酶(LPL)活性采用試劑盒測(cè)定(南京建成生物工程研究所);測(cè)定肉質(zhì)性狀包括 pH(24h)、眼肌面積(longissimus muscle area，LMA)、滴水損失、IMF 含量。測(cè)定方法參照NY/T821－2004和NY/T825－2004。

1.3 H－FABP基因?qū)崟r(shí)定量表達(dá)量的測(cè)定

1.3.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取最后肋背最長(zhǎng)肌樣本30mg左右，加入液氮并研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5mL Eppendorf管中，利用 RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取樣本總RNA，方法按操作說(shuō)明進(jìn)行。提取的總RNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，通過(guò)OD260/280檢測(cè)樣本純度。

用隨機(jī)引物對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)。反應(yīng)體系為 20μL:2μg 總 RNA、1μg隨機(jī)引物、20U Rnasin抑制劑、5μL 5×RT緩沖液、200U M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、0.4mmol/L dNTP。先加RNA模板，dNTP和隨機(jī)引物，70℃變性5min后立即放冰上冷卻2min;再加其余試劑，混勻后42℃延伸60min，而后95℃變性5min，迅速置冰上冷卻得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)豬的H－FABP基因mRNA已知序列(GenBank登錄號(hào):AJ416019)設(shè)計(jì)引物，上游引物為5'－CATGACCAAGCCTACCACAC－3'，下游引物為 5'－ CAAGTTTGCCTCCATCCAG－3'。以持家基因β－actin作為內(nèi)參，根據(jù)豬的β－actin基因mRNA已知序列(U07786)設(shè)計(jì)引物，上游引物為5'－ ATCGTGCGGGACATCAAG－3'，下游引物為 5'－CAGGAAGGAGGGCTGGAA－3'。所有引物均由大連寶生物有限公司合成。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20μL:模板cDNA 2μL、上游引物和下游引物各1μL、SYBR GreenⅠ(含有改良的Hotmaster Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等，TIANGEN 公司)9μL、DEPC 處理水 7μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10min;95℃ 10s，60℃ 30s，共 40個(gè)循環(huán);60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.3.4 相對(duì)表達(dá)量的分析 以β－actin基因作為內(nèi)參基因，選擇一校準(zhǔn)樣本，比較待測(cè)樣本相對(duì)校準(zhǔn)樣本的表達(dá)差異，利用 2－△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析［13］。

相對(duì)表達(dá)率 =2－△△CT

其 中:△△CT = (CTH－FABP－ CTβ－actin)待測(cè)樣本－(CTH－FABP－CTβ－actin)校準(zhǔn)樣本

結(jié)果是通過(guò)參照基因表達(dá)水平校正的待測(cè)樣本中的目標(biāo)基因相對(duì)于校準(zhǔn)樣本的相對(duì)表達(dá)率，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)樣本組織量的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 鉻對(duì)血清指標(biāo)和組織酶活的影響

表1 鉻對(duì)肥育豬肌肉中酶活和血清指標(biāo)的影響

從表1可以看出，添加鉻可以提高肌肉組織蘋(píng)果酸脫氫酶和脂蛋白脂酶的活性，提高幅度分別為8.82%和10.66%，說(shuō)明鉻能夠促進(jìn)肌肉中脂肪的合成代謝。添加鉻降低了血清NEFA和甘油三酯含量，其中對(duì) NEFA含量影響顯著(P＜0.05)，這與Matthews和 Shelton 研究結(jié)果一致。Matthews［14］和Shelton［7］報(bào)道，隨著日糧中鉻濃度的增加，血清中NEFA濃度逐漸降低。本研究結(jié)果表明，鉻對(duì)豬脂類(lèi)代謝具有一定的影響。

2.2 鉻對(duì)肉質(zhì)性狀的影響

從表2可以看出，添加鉻顯著提高了LMA和肌肉pH。Moony［15］報(bào)道，在肥育期添加鉻顯著提高了LMA，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。Matthew［16］研究表明，肥育期添加鉻可以提高肌肉pH。

表2 鉻對(duì)肉質(zhì)性狀的影響

Matthew［6］研究表明，鉻能夠提高肌肉大理石花紋得分，在低能日糧中效果更好。Shelton［7］報(bào)道，在肥育豬日糧中添加鉻可以提高肌肉大理石花紋得分，減少滴水損失、降低蒸煮損失和解凍損失。這與本研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果也表明，在肥育豬日糧中添加鉻增加了IMF含量，減少滴水損失。這表明，鉻能促進(jìn)肌肉中脂肪合成代謝，增加IMF含量，同時(shí)提高肌肉系水力，減少滴水損失。

2.3 H－FABP基因表達(dá)量與脂肪代謝之間的關(guān)系

從表3可以看出，添加鉻顯著提高了肌肉組織中H－FABP基因表達(dá)量。

表3 鉻對(duì)H－FABP基因表達(dá)的影響

Clarke［17］和 Towle［18］研究認(rèn)為，日糧中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)許多基因的表達(dá)有著顯著影響，而這些基因中往往含有控制機(jī)體代謝關(guān)鍵酶的密碼子，從而影響了機(jī)體的代謝過(guò)程。通過(guò)對(duì)H－FABP基因表達(dá)量的分析表明，鉻提高了肌肉組織中H－FABP基因表達(dá)量，使組織轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的能力增強(qiáng)，血清NEFA含量下降，使肌肉組織中脂肪含量增加。因此，提高H－FABP基因表達(dá)量可提高IMF含量。從表4中可以看出，H－FABP基因表達(dá)量與IMF含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.846(P=0.034);與血清中NEFA含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.893(P=0.016)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在豬肥育期，鉻能夠提高H－FABP基因表達(dá)量，進(jìn)而提高IMF含量，減少滴水損失，提高肉質(zhì)。

表4 H－FABP基因表達(dá)量與脂肪代謝之間的關(guān)系

3 結(jié)論

在豬肥育期日糧中添加鉻可以提高H－FABP基因表達(dá)量，提高LMA和IMF含量，減少滴水損失，改善肉質(zhì)，降低血清NEFA含量。

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Effect of chromium(Cr)on pork quality of finishing pigs

XU Yun－h(huán)e1，2，SU Yu－h(huán)ong2，LIU Xian－jun1，LI Bao－long3，BIAN Lian－quan1，*
(1.Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China;2.Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;3.Mianyang Sinyiml Chemical Co.，Ltd，Chengdu 610500，China)

TS251.5+1

A

1002－0306(2010)08－0092－03

2009－11－04 *通訊聯(lián)系人

許云賀(1978－)，男，博士研究生，研究方向:豬肉品質(zhì)調(diào)控。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD71B01;2007BAD71B03)。