姜李雁，李妍妍，邵亮亮，蘇秀榕

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211)

水產(chǎn)品及水發(fā)食品中的甲醛檢測(cè)技術(shù)研究

姜李雁，李妍妍，邵亮亮，蘇秀榕*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211)

目的:建立了快速準(zhǔn)確檢測(cè)水產(chǎn)品、水發(fā)食品中的甲醛含量的方法和技術(shù)。方法:本研究采用微波萃取法和超聲波萃取法代替經(jīng)典的水蒸汽蒸餾法，利用甲醛在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙，利用高效液相色譜法測(cè)定甲醛的衍生物。結(jié)果:該方法線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=1120.13098x+311.61308，線性范圍為0.1～10μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.99801，加標(biāo)回收率在92.3%～110.2%，用于實(shí)際樣品測(cè)定，結(jié)果滿意。結(jié)論:該方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏、適用性強(qiáng)，能滿足水產(chǎn)品、水發(fā)食品中甲醛的測(cè)定。

高效液相色譜，水產(chǎn)品，水發(fā)食品，甲醛

Abstract:Objective:In order to detect formaldehyde in aquatic products and water-risen food fast and accurately，the determination method was established.Methods:Microwave extraction and ultrasonic extraction method took place of the classic steam distillation.The formaldehyde in the sample reacted with the derivation reagent，2，4-dinitrophenylhydrazine，in an acidic medium to form 2，4-dinitrophenylhydrazine，then HPLC was used in determination of formaldehyde derivatives.Results:Results showed that the method had good linear relationship.The linear regression equation was established as Y=1120.13098X+311.61308，with linearity range from 0.1～10μg/mL and correlation coefficient of 0.99801.The recovery range was 92.3%～110.2%.The methods for the actual samples detect got satisfactory results.Conclusion:The method is simple，rapid，accurate，sensitive and applicable for the determination of formaldehyde in aquatic products and water-risen food.

Key words:HPLC;aquatic products;water-risen food;formaldehyde

甲醛是具有致突變和致癌作用的毒害物質(zhì)［1］，是一種非食品添加劑，國家明令規(guī)定在食品中禁止使用防腐劑和漂白劑，但仍有一些不法商販在水產(chǎn)品儲(chǔ)藏加工、水發(fā)食品制作過程中加入甲醛作為防腐劑，導(dǎo)致食品中的甲醛殘留量超標(biāo)。目前，甲醛含量的測(cè)定方法主要有滴定法、分光光度法［2-3］、氣相色譜法［4］、高效液相色譜法(HPLC)［5］、電子鼻測(cè)定法［6］、聚二甲基硅氧烷微流控芯片測(cè)定法［7］等，提取方法主要有振搖提?。?］、水浴提取［9］、直接蒸餾、水蒸汽蒸餾［10-12］、超聲波萃取、微波萃取等。但食品基體成分通常比較復(fù)雜，采用選擇性不高的比色法容易造成假陽性結(jié)果。針對(duì)市場(chǎng)上多次出現(xiàn)水發(fā)食品含有甲醛的違法事件，本文對(duì)水產(chǎn)品、水發(fā)食品中甲醛的測(cè)定，采用超聲波萃取與微波萃取，并做了比較，建立了高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品及水發(fā)食品中甲醛殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醛、2，4-二硝基苯肼、二氯甲烷、無水硫酸鈉分析純;甲醇 色譜純;過膜超純水(膜孔徑0.45μm)。

1120LC高效液相色譜附帶紫外檢測(cè)器(G1314B) 美國Agilent公司;UV0810M111紫外分光光度計(jì) VARIAN公司;DKS-26電熱恒溫水浴鍋

寧波江南儀器廠;TGL-168臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;MVS-1旋渦混合器 北京北德科學(xué)器材有限公司;CQ 25-12D超聲波 寧波江南儀器廠;4mL M道管、一次性濾膜(孔徑0.22μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)定 移取2.8mL甲醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%～40%)于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。吸取20.00mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于250mL碘量瓶中，加入20.00mL碘標(biāo)準(zhǔn)溶液，15mL氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15min，加入20mL硫酸溶液，搖勻，再放置15min。加入50mL水，搖勻，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至淺藍(lán)色時(shí)，加入1mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

計(jì)算公式:

式中，X:甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/mL;V1:滴定試劑空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V2:滴定甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;C:硫代硫酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度，mol/mL;15:1.00mL碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)甲醛的質(zhì)量，mg;V3:標(biāo)定甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:XDB-C8柱(4.6mm×150mm，5-Micron);流動(dòng)相為甲醇∶水 =70∶30，應(yīng)用前分別經(jīng)0.45μm有機(jī)系、水系濾膜過濾和超聲波脫氣;流速為0.5mL/min;紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長為351nm;進(jìn)液量為20μL;柱溫為40℃。

1.2.3 樣品的前處理 稱取切碎的樣品5.0g，放入15mL帶塞試管中，加入相應(yīng)的純水5mL。超聲波萃取30min，靜置后用移液管移取上清液至4mL離心管中，在6250r/min下離心10min，取1mL上清液加入1g/L的2，4-二硝基苯肼溶液0.5mL，置于60℃水浴上20min，在流水中快速冷卻，以二氯甲烷每次1mL進(jìn)行3次萃取，用漩渦振蕩器振搖1min，在6250r/min下離心10min，取下層萃取液并用無水硫酸鈉脫水，60℃水浴上蒸干，冷卻后加甲醇 1mL溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm濾膜過濾后，取20μL進(jìn)樣，測(cè)量保留時(shí)間和峰面積。

1.2.4 醛標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取10mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0、20、40、60、80、100、200、300、400、500、600、700、800、900μL 于4mL M 道管中，加純水至 1.0mL，按樣品衍生的方法處理后，分別測(cè)定并計(jì)算其峰面積A值。以A值為縱坐標(biāo)，用A所對(duì)應(yīng)各濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

將同一樣品切碎后，稱取5g樣品，加入5mL純水后，分別采用振搖提取:在搖床內(nèi)振搖30min;超聲波萃取:室溫下，在超聲波清洗機(jī)內(nèi)超聲波萃取30min，萃取溫度25℃左右，萃取功率1500W;微波萃取:萃取溫度70℃，萃取時(shí)間15min，爬坡時(shí)間5min，冷卻時(shí)間5min，提取甲醛后，經(jīng)1.2.3方法分析后，比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果，見表1。

超聲波萃取、微波萃取與振搖、蒸餾等方法相比，操作簡單，提取時(shí)間明顯縮短，提取效率高。超聲波萃取時(shí)間為30min，微波萃取時(shí)間為15min，微波萃取樣品可進(jìn)一步搗碎混勻，相對(duì)萃取較徹底，但萃取液離心后蛋白等雜質(zhì)含量較高，不利于衍生化。超聲波萃取后萃取液較易分離，衍生化較容易，但萃取時(shí)間相對(duì)較長。兩種萃取方法各有利弊。

表1 不同提取方法測(cè)得甲醛含量(mg/mL)

2.2 檢測(cè)波長的選擇

在200～800nm范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行波長檢測(cè)(如圖1)，發(fā)現(xiàn)甲醛與2，4-二硝基苯肼衍生物在351nm波長處吸收最強(qiáng)，信號(hào)干擾小，因此，本文選定檢測(cè)波長為351nm。

圖1 甲醛衍生物紫外光譜

2.3 分離條件的確定

分別以(甲醇)∶(水)=50∶50、60∶40、70∶30、80∶20進(jìn)行測(cè)定，受流動(dòng)相配比對(duì)色譜峰的影響，幾種比例均能使色譜峰分離，目標(biāo)物出峰時(shí)間分別為11.275，9.048，5.897，4.713min。經(jīng)比較認(rèn)為(甲醇)∶(水)=70∶30時(shí)，靈敏度高，色譜峰分離較好，保留時(shí)間適宜，故選定流動(dòng)相配比為(甲醇)∶(水)=70∶30。

2.4 柱溫的確定

對(duì)同一衍生后的甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采取25、30、35、40、45℃進(jìn)行測(cè)定(如圖2)。實(shí)驗(yàn)表明:甲醛衍生物的峰面積隨柱溫的升高而增大，當(dāng)柱溫達(dá)到40℃時(shí)，色譜峰面積達(dá)到最大值，柱溫繼續(xù)升高，峰面積劇減?？梢姡?0℃時(shí)甲醛衍生物最易被分離檢測(cè)，因此選擇40℃作為甲醛衍生物的液相柱溫。

圖2 柱溫變化曲線圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得回歸方程為線Y=1120.13098X+311.61308，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.99801，線性范圍為0.1～10μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3、圖4。

圖3 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖4 甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 回收率

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，取1mL樣品按1.2.3進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定甲醛含量。取同一樣品0.5mL，分別加入0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)樣品0.5mL，混勻后，按1.2.3進(jìn)行反應(yīng)。然后測(cè)定，得到數(shù)據(jù)如表2。

計(jì)算公式［13］:

式中，R:回收率;JBY:加標(biāo)樣品的甲醛含量;Y:樣品中的甲醛含量;B:理論加標(biāo)量;2JBY-Y:實(shí)際測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)含量。

表2 樣品中甲醛的回收率

2.7 樣品的檢測(cè)

按1.2.3方法分析各類水產(chǎn)品，以及市售的7種水發(fā)蘑菇樣品，測(cè)定結(jié)果見表3，測(cè)定結(jié)果與常用的乙酰丙酮比色法基本一致。

3 結(jié)論

本方法采用C8柱的高效液相色譜法測(cè)定甲醛的2，4-二硝基苯肼衍生物，間接測(cè)定甲醛含量。該法與乙酰丙酮比色法相比，具有檢測(cè)極限低、線性范圍寬、衍生物穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)、回收率高、操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。甲醛衍生與提取步驟簡便、易操作，樣品被測(cè)組分保留時(shí)間小于6min，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)比傳統(tǒng)的滴定法、分光光度計(jì)法準(zhǔn)確，且節(jié)省了大量的分析時(shí)間。

表3 不同樣品中甲醛的含量

［1］楊振洲，蔡同建.室內(nèi)甲醛的危害及其預(yù)防［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19(6):765.

［2］衛(wèi)生部.消毒技術(shù)規(guī)范［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部，1997:74.

［3］衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2002年版)［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部，2002:188.

［4］顧秀英，鮑忠定，許榮年，等.衍生氣相色譜法測(cè)定啤酒中的甲醛［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(6):116-118.

［5］宋新.高效液相色譜法測(cè)定水發(fā)食品中甲醛［J］.中國公共衛(wèi)生，2004，20(7):863.

［6］Shunping Zhang，Changsheng Xie，Zikui Bai，et al.Spoiling and formaldehyde-containing detections in octopus with an E-nose［J］.Food Chemistry，2009，113:1346-1350.

［7］Xuan Weng，Chan Hee Chon，Hai Jiang，et al.Rapid detection of formaldehyde concentration in food on a polydimethylsiloxane(PDMS)microfluidic chip［J］.Food Chemistry，2009，114:1079-1082.

［8］張志剛，施冰，林陰輝，等.高效液相色譜法測(cè)定食品中微量甲醛方法研究［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14:36-38.

［9］唐正群，姜淑玲，徐敏，等.水產(chǎn)品浸泡液中甲醛的檢測(cè)［J］.職業(yè)與健康，2006，22(13):970.

［10］彭科懷，陳江，趙年華，等.高效液相色譜法測(cè)定啤酒中微量甲醛方法研究［J］.西南民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，26(2):159-162.

［11］陳銘學(xué)，牟仁祥，應(yīng)興華，等.高效液相色譜法測(cè)定糧食制品中甲醛殘留量［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2004，23(5):74-76.

［12］迂君，李東，等.高效液相色譜法測(cè)定海產(chǎn)品中的甲醛［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16(7):833.

［13］劉先利.關(guān)于回收率計(jì)算公式［J］.中國環(huán)境監(jiān)測(cè)，1989，5(5):51.

Study on formaldehyde testing technology of aquatic products and water-risen food

JIANG Li-yan，LI Yan-yan，SHAO Liang-liang，SU Xiu-rong*
(Life Science and Biotechnology of Ningbo University，Ningbo 315211，China)

TS254.7

A

1002-0306(2010)08-0351-03

2009-08-12 *通訊聯(lián)系人

姜李雁(1986-)，女，碩士在讀，研究方向:食品安全與檢測(cè)。