宋 軍，趙林華，姬航宇，冀博文，仝小林

（中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100053）

近年來，糖尿病的發(fā)病率及患病率逐年升高，糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防與治療已成為重大的公共衛(wèi)生問題。胰島β細(xì)胞分泌缺陷和胰島素抵抗是糖尿病的重要病理生理基礎(chǔ)，目前 β細(xì)胞功能缺陷的機(jī)理尚未完全闡明。PPARs是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于細(xì)胞核激素受體超家族，分為PPARα、PPARβ 和 PPARγ 3種。研究表明，PPARα激動劑可以明顯降低小鼠血清FFA及甘油三酯水平，使血糖和血胰島素水平恢復(fù)正常，反轉(zhuǎn)脂毒性狀態(tài)，并能改善葡萄糖代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本研究即通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究PPARα對 β細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 INS-1細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要儀器 GeneAmp 5700 TaqMAN PCR儀，美國 Applied Biosystems公司；凝膠圖像分析儀 ImageMaster VDS，美國 pharmacia Biotech公司；高速冷凍離心機(jī)，德國 BACKMAN公司；Allagra.21R Centrifcige；紫外線分光光度計(jì)，德國BACKMAN公司 DU640型，電泳儀，北京六一儀器廠，OYY-Ⅲ-5 型。

1.1.3 主要試劑 軟脂酸、牛血清白蛋白BSA（Sigma），RPMI1640 培 養(yǎng) 基（Gibco），Trizol（Invitrogen），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），SYBR GreenPCR MasterMix（Applied Biosystems），引物采用 primer premier5.0設(shè)計(jì)，由賽百盛公司合成，胰島素ILISA試劑盒（美國millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 糖敏靈丸水煎劑按臨床成人（60kg）每天服用生藥10倍給SD大鼠灌胃，即每天給藥劑量=人每天治療劑量 ×動物等效劑量系數(shù)×10倍。每只每次給藥2ml（每1ml水煎液含1g生藥），每日2次，連續(xù)3d，生理鹽水對照組給以同劑量的生理鹽水。末次灌胃前禁食12h、末次灌胃后1h，腹主動脈采血靜置2h，3000r/min離心15min，分離血清，經(jīng) 56℃ 30min滅活處理后，用0.45um微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型的建立及分組 實(shí)驗(yàn)共分7組，正常組INS-1細(xì)胞置于含完全1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5d，后以完全1640培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)2d。其余6組均取同代INS-1細(xì)胞置于含高濃度軟脂酸0.5mmol/L+高濃度葡萄糖20mmol/L的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)5d，而后模型組以完全1640培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)2d。小、中、大劑量組分別以5％、10％、15％含藥血清的完全1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d。血清對照組以正常小鼠血清的完全1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d。羅格列酮組以含10μmol/L羅格列酮的完全1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d（注：每組復(fù)孔5個(gè)）。

1.2.3 指標(biāo)檢測 采用ELISA試劑盒進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)，以評價(jià)胰島細(xì)胞對葡萄糖刺激的應(yīng)答能力。采用RT-PCR法檢測PPARα：根據(jù)已報(bào)道的序列設(shè)計(jì)引物。選用 β-actin作為內(nèi)參照以進(jìn)行 RT-PCR半定量分析。PPARα引物序列：上游引物為：5′-TTT ACC ACG GTT GAT TTC TC-3′，下游引物為 5′-GCT TCA ATC GGA TGG TTC TT-3′；擴(kuò)增長度 319bp。β-actin：上游 5′-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′，下 游：5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′，擴(kuò)增片斷長度為240bp。RT-PCR反應(yīng)體系按試劑盒說明書進(jìn)行制備。擴(kuò)增后取 PCR產(chǎn)物5μL用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比較選定的基因的表達(dá)時(shí)，采用CT值代表實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果，GAPDH作為組織的內(nèi)參照，ΔCT =CT目的基因－ CT管家基因，ΔΔCT = ΔCT治療組－ΔCT對照組，根據(jù)公式可以計(jì)算出各組基因表達(dá) =2－ΔΔCT。2－△△CT＞1，目的基因表達(dá)上調(diào)，反之下調(diào)。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 糖敏靈丸對胰島素釋放實(shí)驗(yàn)的影響

表1顯示，糖敏靈丸能夠促進(jìn)高糖環(huán)境下胰島素的分泌，并具有劑量依賴性，劑量越大越能促進(jìn)胰島素分泌。

2.2 糖敏靈丸對PPARα的影響

2.2.1 PCR法檢測各樣本的擴(kuò)增曲線都已到達(dá)平臺期，熔解曲線均未檢測到引物二聚體及其他非特異性熒光信號（見圖1）。

表1 糖敏靈丸對胰島素釋放試驗(yàn)的影響（mg/ml）

圖1 PCR檢測各樣本PPARα的表達(dá)

2.2.2 PCR檢測結(jié)果顯示糖敏靈丸大劑量組能明顯升高PPARα基因mRNA的表達(dá)（見表2）。

表2 糖敏靈丸對PPARα的影響

3 討論

過氧化物酶體增殖激活受體α在組織中廣泛分布，包括胰腺中的胰島。Yoshikawa等用軟脂酸培養(yǎng)胰島8h，發(fā)現(xiàn)葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）增加，伴隨有丙酮酸梭化酶（PC）mRNA或PPARα的增加。相比之下，培養(yǎng)48 h后 GSIS或胰島中胰島素含量顯著下降，同時(shí) PC、PPARα、GLUT-2、葡萄糖激酶（GK）、前胰島素原或PDX-1 mRNA受抑制，這些數(shù)據(jù)可能提示，短期軟脂酸培養(yǎng)可促進(jìn)PPARα基因表達(dá)，后者增加PC mRNA表達(dá)，引起胰島素釋放。而長期軟脂酸培養(yǎng)，抑制 PPARα mRNA，后者可能通過對PDX-1mRNA的抑制使PC mRNA表達(dá)下降，且軟脂酸使 GLUT-2，GK或前胰島素原mRNA表達(dá)下降。然而，Tordiman等分別用含PPARα腺病毒轉(zhuǎn)染和 PPARα激動劑處理 INS-1β細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者皆增加軟脂酸氧化，但降低胰島素分泌，同時(shí)使UCP2表達(dá)增加了2倍，提示 FFAs氧化損傷β細(xì)胞功能與PPARα途徑有關(guān)。

糖敏靈丸由黃連、大黃、白芍、柴胡、天花粉等組成，具有開郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁的功效，主要用于治療2型糖尿?。ǜ挝赣魺嶙C），癥見口苦咽干、大便秘結(jié)、胸脅或胃脘脹滿、煩躁易怒、舌紅苔黃、脈弦滑數(shù)等。臨床前藥效學(xué)研究顯示，該藥對于正常及糖尿病模型動物均有顯著降低血糖的作用。實(shí)驗(yàn)選取了被廣泛用于研究β細(xì)胞生長及存活因子的Ins-1細(xì)胞系進(jìn)行高糖高脂培養(yǎng)以誘導(dǎo)胰島細(xì)胞功能損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大劑量組糖敏靈丸能夠促進(jìn)高糖環(huán)境下胰島素的分泌，其效果與羅格列酮相似。且可以顯著降低PPARα含量，從而改善胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能。

根據(jù)我們多年的臨證實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病的發(fā)生、發(fā)展與肝及脾胃功能失調(diào)有密切關(guān)系，即肝氣郁滯、脾氣虛弱、胃腸燥熱導(dǎo)致氣機(jī)升降失調(diào)。糖敏靈丸方中以柴胡、黃芩疏泄少陽郁滯，宣透邪熱；枳實(shí)、黃連、大黃疏泄胃腸，清瀉陽明邪熱；清半夏與大黃配伍辛開苦降，開暢中焦。方中辛苦合擬，寓有辛開苦降之法，用于治療中焦脾胃升降失常、氣機(jī)阻滯而致的糖尿病。辛則升清，苦則降濁，辛開苦降調(diào)暢中焦，宣泄三焦氣機(jī)，全方配伍可疏肝郁，清胃熱、腸熱，健脾胃，從而使氣機(jī)升降有序，氣化正常，氣、血、津、液等體內(nèi)物質(zhì)代謝（糖、脂肪等）歸于正常。

△通訊作者：仝小林，男，54歲，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，中華中醫(yī)藥學(xué)會糖尿病分會主任委員，從事中醫(yī)內(nèi)分泌學(xué)研究。