王者令，劉中景，宋 霆，羅瑋敏，孫曉慧

（青島市傳染病醫(yī)院，山東 青島 266033）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

中藥：購(gòu)置于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定教研室鑒定。

中藥以“桃紅活血湯”為基本方（赤芍、丹參、桃仁、紅花），并結(jié)合2006年8月中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)《肝纖維化中西結(jié)合診療指南》臨床肝硬化常見(jiàn)辨證分型，以肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛3種分型為“扶正”組方，組成扶正活血共3個(gè)不同方劑（簡(jiǎn)稱1號(hào)方、2號(hào)方、3號(hào)方）。

1號(hào)方（活血化瘀健脾益氣）：桃紅活血湯加黃芪、黨參、白術(shù)、炙甘草；2號(hào)方（活血化瘀滋養(yǎng)肝腎）：桃紅活血湯加熟地、白芍、麥冬、枸杞子；3號(hào)方（活血化瘀溫補(bǔ)脾腎）：桃紅活血湯加附子、干姜、炙甘草、肉蓯蓉、菟絲子。

藥物制備：將扶正活血方原藥浸泡20min（水浸過(guò)藥面2cm），武火煮沸后改用文火煎30min，冷卻30min后濾渣取汁，將濾渣如上法再煎煮2次取汁。將2次藥汁混合，用文火適度，濃縮至120ml，濃度為0.75kg/L，制成扶正活血方大劑量水煎劑，置冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

西藥：秋水仙堿（昆明制藥集團(tuán)有限公司），購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)一附院西藥房。

秋水仙堿灌胃藥液的制備：秋水仙堿，成人（60kg）的日用量為1mg，大鼠的劑量為成人用量的30倍（即0.25mg/kg），使用時(shí)以蒸餾水調(diào)制藥液成0.025g/L。

1.2 動(dòng)物及試劑

SD大鼠購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，HSC-T6細(xì)胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所提供，RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO公司，注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素為哈藥集團(tuán)制藥總廠，小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司，Trypsin 1∶250（胰蛋白酶）為美國(guó) Difco公司，EDTA為美國(guó)GIBCO公司，PI為美國(guó) SIGMA公司，RNase為美國(guó)SIGMA公司，MTT為美國(guó)SIGMA公司。

1.3 含藥血清動(dòng)物分組及標(biāo)本采集

將SD大鼠隨機(jī)分為正常血清對(duì)照組（簡(jiǎn)稱正常組）、秋水仙堿對(duì)照組（簡(jiǎn)稱陽(yáng)性組）、扶正活血組（1號(hào) ～3號(hào)組）共5組，每組6只；以上各組均以相應(yīng)的藥物灌胃（正常血清對(duì)照組以生理鹽水灌胃），灌胃量均為1ml/l00g體質(zhì)量.每天灌胃2次，間隔12h，連續(xù)給藥 3d。

末次給藥后1h采血（灌藥前禁食不禁水12h），10g/L戊巴比妥鈉（0.35mL/100g）腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫下靜置4h，3000r/min離心15min，分離血清，同組血清相混，將各組血清用56℃水浴滅活30min，以除去可能存在的生物活性物質(zhì)，再用0.22pm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置 －20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HSC-T16細(xì)胞分組及各組工作液的配制

將對(duì)數(shù)分裂期的HSC-T6細(xì)胞接種入培養(yǎng)板后，以孔為單位，先按以上大鼠血清分組，每大組又按工作液中的含藥血清濃度（50、100、200ml/L的含藥血清分為3個(gè)小組，每小組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

低濃度小組（含50ml/L正常大鼠血清）：10μl正常大鼠血清 +190μl DMEM；中濃度小組（含100ml/L正常大鼠血清）：20μl正常大鼠血清 +180μl MEM；高濃度小組（含200ml/L大鼠血清）：40 μl正常大鼠血清+160μl DMEM。

1.5 MTT比色法檢測(cè)肝纖維化HSC-T6增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，在96孔板中培養(yǎng)12h，加入不同濃度的扶正活血方含藥血清，培養(yǎng)48h，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。

（1）待HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，并接種至無(wú)菌96孔板內(nèi)，細(xì)胞接種密度約為5 x 106個(gè)/L，每孔加入細(xì)胞懸液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)；（2）在 37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)液（每孔200μL）培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化于靜止期；（3）棄上清，各孔按實(shí)驗(yàn)分組要求加入相應(yīng)的工作液，移入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h；（4）48h后取出培養(yǎng)板，每孔加入 MTT溶液 20μl，37℃、繼續(xù)培養(yǎng) 4h后，小心吸去上清，每孔加入DMSO 200μl，室溫下，用微型超聲振蕩器混勻。

1.6 結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為450nm）測(cè)定每組細(xì)胞A值，重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100％。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

表1、圖1顯示，各組含藥血清低濃度小組和中濃度小組，對(duì)HSC-T16細(xì)胞增殖抑制率很低，只在其高濃度時(shí)顯示有不同程度的抑制效果。與正常對(duì)照組比較，扶正活血各組方動(dòng)物含藥血清對(duì) HSCT16細(xì)胞增殖抑制率均有顯著性意義（P＜0.01），而和陽(yáng)性藥物組比較則無(wú)顯著性差異。

表1 各組高濃度含藥血清對(duì)HSC-T6增殖抑制率±s）

表1 各組高濃度含藥血清對(duì)HSC-T6增殖抑制率±s）

注：與正常組比較：△△P＜0.01

組別OD值（570nm） 抑制率（％）0.98±0.19 0秋水仙堿組 0.46±0.05△△ 49 1 號(hào) 方 組 0.32±0.07△△ 67 2 號(hào) 方 組 0.44±0.05△△ 49 3 號(hào) 方 組 0.64±0.13△△正常對(duì)照組30

3 討論

HSC是用SV-60轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)15d的大鼠HSC建立起來(lái)的，它保留了所有激活HSC的特點(diǎn)，可以表達(dá)結(jié)蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和膠原纖維酸性蛋白，至少傳40代仍能保持穩(wěn)定的表型［1］。對(duì)目前應(yīng)用HSC-T6進(jìn)行的多項(xiàng)研究證明，它與原代培養(yǎng)的HSC生物性狀基本一致，其增殖能力較強(qiáng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)間較早，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，易于培養(yǎng)和維持，具有很高的穩(wěn)定性，是一個(gè)良好的進(jìn)行藥理學(xué)細(xì)胞水平研究的模型［2～3］?；罨?HSC數(shù)量的增加是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，而近年來(lái)研究證實(shí)［4］，中醫(yī)扶正活血治則均有抑制 HSC增殖的作用。本研究結(jié)果顯示，扶正活血不同組方的含藥血清對(duì)HSC的增殖有明顯抑制作用。

［1］Niteo N，F(xiàn)rideman SL，Green wel p，et al.Cyp21 mediated oxidative stressinduces collaten type 1 xwpression in rat hepatic stellate cells［J］.Hepatology，1999，30：987-996.

［2］Ankoma-sey V，Wang Y，Dai Z，Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in activated rat hepatic stellate ce1ls［J］.Hepatology，2000，31：141-148.

［3］Coats S，F(xiàn)lanagan WM，Nourse J，et al.Equirement of p27 Kipl for restriction point control of the fibroblast cell cycle［J］.Science，1996，272：877.

［4］蔡銳，伍參榮，胡海平，等.桃紅四物湯加丹參對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（6）：22-24.